干擾素α-2b突變體的分子獲得及性能分析.pdf

1、目的： 干擾素α(Interferon-α，IFN-α)是一類重要的細胞因子，具有廣譜抗病毒、抗細胞分裂和免疫調節(jié)作用，臨床上廣泛應用于多種病毒性疾病和腫瘤的治療。IFN作為蛋白質類藥物，主要存在生物半衰期短和活性不穩(wěn)定的問題，前者要求給病人頻繁注射，后者致使藥物在大劑量長期使用時產生較大副作用，因此開發(fā)長效和高效的IFN是目前的發(fā)展方向。 通過改變分子內蛋白酶水解位點可以影響IFN的性能。本研究在分析IFNα-2b分子

2、結構的基礎上，選擇處于非受體結合位點、位于空間結構表面且非保守序列的糜蛋白酶和谷氨酸-C內蛋白酶水解位點作為突變點，分別將第58位谷氨酸、第89位酪氨酸和第159位谷氨酸通過定點突變技術采用組氨酸進行置換。經(jīng)Percent Accepted Mutation Matrix分析認為這三個位點被組氨酸置換后在進化上不會造成太大的差異，且不會產生新的蛋白酶的酶切位點。通過此結構改建，期望獲得活性增高、分子更加穩(wěn)定的新型IFNα-2b突變體。本

3、研究的目的之一是從分子水平改變IFN，構建兩條突變體分子：突變體1：IFNα-2bHis58；突變體2：IFNα-2bHis89/His159。 通過克隆IFNα-2b兩突變體基因，并保留未突變的IFNα-2b基因，以便于從生物學活性及體內穩(wěn)定性上對三者進行比較，探討能否通過這一方法達到保證和改善必需的生物活性的同時改善IFN在血液中的穩(wěn)定性，這是本研究的目的之二。 方法與結果： 1、IFNα-2b及其兩突變體基

4、因的克隆與構建 本課題利用定點突變PCR的方法，將IFNα-2b分子上第58位Glu突變?yōu)镠is，得到IFNα-2b突變體1：IFNα-2bHis58；將IFNα-2b分子上第89位Tyr突變?yōu)镠is，第159位Glu突變?yōu)镠is，得到IFNα-2b突變體2：IFNα-2bHis89/His159。為了進行比較，同時擴增了未突變的IFNα-2b基因。將擴增的這三段基因和原核表達載體pET23b分別用NdeI和EcoR I雙酶切，

5、再用T4DNA連接酶將pET23b與三段基因分別連接，所得的重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，進行篩選鑒定。 三個重組質粒經(jīng)NdeI和EcoR I雙酶切鑒定表明在500bp處有一特異性條帶，這與兩條分子的DNA序列的大小501bp相符；菌體PCR表明成功轉化，為陽性克??；重組質粒經(jīng)DNA序列測定表明，其核苷酸序列和預期結果一致，證實三段基因均正確插入質粒中，成功構建重組表達質粒。 2、IFNα-2b及其兩突變體蛋白

6、的表達及純化 含有重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)小量培養(yǎng)后，采用搖瓶培養(yǎng)大量制備IFNα-2b及其突變體蛋白。搖瓶培養(yǎng)結束后離心收集并洗滌菌體，采用超聲破菌的方式獲得包涵體。包涵體經(jīng)洗滌、增溶后，用7mol/L的鹽酸胍變性，用硼酸鹽緩沖液復性，復性液透析后，先后經(jīng)陰離子交換層析和陽離子交換層析，得到較純的IFNα-2b及其突變體蛋白。 用15％還原性SDS-PAGE電泳檢測表達量，目的蛋白的表達量大于40％，主要

7、以包涵體的形式存在，表達產物的分子量在20KDa左右，這與IFNα-2b的理論分子量相符。經(jīng)15％非還原性SDS-PAGE電泳檢測表明純度在95％以上。 3、IFNα-2b及其突變體的質量檢測 IFNα-2b突變體的分子量采用基質輔助激光解吸附飛行時間質譜法測量；IFNα-2b及其突變體的濃度采用Lowry法測定；采用細胞病變抑制法(CPE)測定IFNα-2b及其突變體的生物活性，計算其比活性。 結果：IFNα

8、-2bHis58的分子量為19239.98，與其理論分子量完全相符；IFNα-2b比活性大于1.68×108IU/mg、IFNα-2bHis58比活性大于3.46×108IU/mg、IFNα-2bHis89/His159的比活性大于2.80×108IU/mg。由測活結果得知IFNα-2bHis58的活性較突變前提高一倍多，IFNα-2bHis89/His159的活性也較突變前有所提高。 4、IFNα-2b及其突變體的初步藥代動力

9、學試驗 以SD大鼠進行初步藥代動力學研究，三種IFN各為一組，每組六只大鼠，經(jīng)皮下注射給藥2.5×107IU/kg，按設計好的時間點經(jīng)鼠尾靜脈取血，用CPE法檢測各血清樣品中IFN的保留活性，繪制血藥活性-時間曲線，采用DAS軟件進行數(shù)據(jù)擬合，分析藥代動力學參數(shù)。 結果：表明IFNα-2b的t1/2β為1.72h，IFNα-2bHis58的t1/2β為2.30h，IFNα-2bHis89/Hjs159的t1/2β為2.3

10、4h，半衰期較突變前略有延長。 結論： 1、本研究采用分子生物學、生物信息學和計算機輔助設計的辦法設計了2條IFNα-2b突變體分子，成功構建了IFNα-2b突變體基因，并完成了工程菌構建。 2、確定了IFNα-2b突變體的培養(yǎng)條件，包涵體的表達量在40％以上。 3、摸索到了IFNα-2b突變體的分離純化工藝，流程簡單，得率較高，純度達到95％以上。為IFNα-2b的生產探索到了簡單的方法。 4、