ENU誘變獲得一種多趾小鼠及其突變基因的鑒定.pdf

1、乙?；鶃喯趸?Ethylnitrosourea，ENU)是一種人工合成能夠?qū)е露喾N生物體產(chǎn)生隨機(jī)單堿基突變的高效烷化劑，利用ENU誘變可在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量突變小鼠。本實(shí)驗(yàn)室采用ENU誘變手段，篩選獲得了一種常染色體顯性遺傳的多趾突變小鼠，該突變小鼠呈現(xiàn)出軸前多趾現(xiàn)象，嚴(yán)重程度不一。本研究以這種突變系小鼠為對(duì)象，對(duì)突變基因進(jìn)行了染色體定位，在初步確定了Alx4為該突變候選基因基礎(chǔ)上，對(duì)Alx4基因進(jìn)行了序列分析，確定Alx4基因突變是

2、引起多趾表型的主要原因。我們的工作分以下2個(gè)部分:
　　 1、多趾小鼠的獲得及突變基因的定位
　　 ENU人工誘變后，在G1代小鼠中篩查發(fā)現(xiàn)了一例多趾突變表型的小鼠。將其與野生型C57BL/6J(B6)B6小鼠配種后記錄的71只后代小鼠中，有15只后代出現(xiàn)多趾表型。將后代正常表型小鼠進(jìn)一步與B6野生型交配，部分小鼠后代存在多趾表型，以上結(jié)果說明該突變表型屬于一種呈不完全外顯率的顯性遺傳。B6多趾小鼠與野生型DBA/2J(

3、D2)配種獲得的19只后代小鼠中，有4只多趾突變。(B6×D2)F1代多趾突變小鼠回交B6得到的317只[(B6×D2)F1×B6]N2代小鼠中，有61只多趾突變。N2代突變小鼠互交得到的25只后代中有12只雜合子，6只純合子，7只正常。
　　 突變雜合子小鼠在后趾內(nèi)側(cè)（即軸前部）比正常小鼠多出一個(gè)腳趾，且嚴(yán)重程度不一;純合子則更為嚴(yán)重，不僅前后肢都有多趾（多達(dá)7趾），而且后肢畸形，另外發(fā)現(xiàn)新生純合子小鼠存在眼瞼開裂現(xiàn)象。阿爾新

4、藍(lán)—茜素紅染色結(jié)果顯示突變雜合子小鼠與野生型相比，在后趾軸前部明顯多出一趾，純合子四肢多趾，后肢脛骨畸形，生長(zhǎng)不全。多出的趾有的是與正常趾并行長(zhǎng)出，有的則在原來的腳趾上長(zhǎng)出一個(gè)分支，其他骨骼-軟骨與正常相比未見明顯異常。
　　 為了定位該突變基因，提取[(B6×D2)F1×B6]N2代小鼠的鼠尾DNA，利用44個(gè)微衛(wèi)星對(duì)突變小鼠的常染色體和X染色體進(jìn)行基因組掃描。第一輪篩選發(fā)現(xiàn)突變基因與2號(hào)染色體上的微衛(wèi)星D2mit58在28個(gè)

5、中交換了5例，LOD值為2.71，有可能連鎖，而其余微衛(wèi)星均無連鎖傾向。在初步掃描基礎(chǔ)上，在D2Mit58附近繼續(xù)采用高密度微衛(wèi)星標(biāo)記并擴(kuò)大N2代突變小鼠樣品的數(shù)目，進(jìn)一步定位結(jié)果表明在60個(gè)樣品中突變基因分別與微衛(wèi)星D2mit184(53.07cM)交換5例，LOD值為10.59;與D2mit45(50.63cM)交換4例，LOD值為11.68，確定連鎖，并將突變基因定位于微衛(wèi)星D2Mit184與D2Mit45之間，通過對(duì)局部區(qū)域基因

6、功能分析初步判定Alx4基因?yàn)楸就蛔兒蜻x基因。
　　 2、Alx4基因的序列分析
　　 針對(duì)Alx4基因的4個(gè)外顯子在其兩側(cè)設(shè)計(jì)了4對(duì)引物，對(duì)Alx4基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收后經(jīng)過測(cè)序比對(duì)，最終發(fā)現(xiàn)多趾雜合子小鼠測(cè)序圖上單位點(diǎn)存在明顯的A-T重疊信號(hào)，RT-PCR測(cè)序結(jié)果與基因組DNA測(cè)序結(jié)果一致。該突變位于Alx4基因編碼區(qū)第433位堿基處（位于Alx4基因第2號(hào)外顯子），突變導(dǎo)致編碼區(qū)第145位密碼子AA