一種新的HBV全基因組克隆技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

1、研究背景 乙型病毒性肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，是肝硬化和肝細胞癌的主要病因。在國家＂九五＂及＂十五＂規(guī)劃中，均將其列入影響我國國民經(jīng)濟和社會發(fā)展的重大疾病。全世界有3.5億慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)攜帶者，我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶率為9.09％，約1億多人，HBV感染在我國是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。 由于HBV基因組是一個雙鏈非閉合的松弛結(jié)構(gòu)，兩鏈的

2、不等長，加上基因長度為3.2Kb，使得全基因組擴增和克隆很難，直到1995年美國學(xué)者Gunther成功進行HBV全基因擴增，使得HBV全基因組的體外研究成為可能，但該方法的克隆效率較低，不利于進一步對HBV基因的研究。本研究試圖在前人的基礎(chǔ)上，建立一種新的更高效的HBV全基因組克隆技術(shù)。 研究目的 1．通過引物和酶切位點的設(shè)計和載體的合理選擇，建立一種HBV全基因組擴增及克隆的新方法，并對該方法的擴增和克隆效率，以及

3、敏感性、保真性等進行分析。 2．將建立的方法對12例患者血清標(biāo)本進行克隆和測序，并進行生物信息學(xué)分析，了解這些患者HBV全基因組的特性。 材料與方法： 本研究所用的HBV感染者血清均來自到中山三院感染科就診的患者，采集了12例慢性乙型肝炎(CHB)患者追蹤9個時段共85份血清。所用的實驗試劑根據(jù)需要購自不同的生物公司，實驗主要在中山三院中心實驗室完成。 1．血清HBV DNA滴度測定：85份血清全部進行實

4、時熒光定量PCR法檢測，血清HBVDNA滴度以拷貝／毫升表示，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。 2．引物設(shè)計、基因擴增和克?。和ㄟ^對前人的引物進行分析，合成兩對引物，對85份血清進行兩片段擴增，成功80份，即進行連接和T-A克隆，鑒定。同時白行設(shè)計兩對引物，分別對85例血清進行一片段的PCR擴增，各成功29份，然后分別進行T-A克隆、PblueScript SK(-)克隆，和酶切鑒定。比較兩種擴增方法的效率和兩種克隆方法的效率。

5、 3．一片段法保真性鑒定：對克隆成功的5個樣本提取質(zhì)粒，再次進行擴增和測序，通過擴增前后序列的分析，了解一片段法的保真性。 4．一片段法敏感性分析：提取10份克隆成功的質(zhì)粒DNA，采用遞等稀釋法進行稀釋，以稀釋的質(zhì)粒DNA為模板，進行一片段擴增，通過分析擴增效率，了解一片段法的敏感性。 5．一片段法實用效果分析：將一片段克隆技術(shù)應(yīng)用到12個患者血清樣本上，并進行測序，運用生物信息學(xué)的方法對HBV基因進行分析。

6、 結(jié)果 1．兩種方法擴增的效率：以二片段方法擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，酶切鑒定，可以出現(xiàn)分別為2.05kb和1.15kb的兩條帶，兩條帶分子量加起來為3.2kb。一片段方法只能見到一條3.2kb的條帶。但一片段方法擴增的成功率低于二片段方法(p<0.05)，且一片段法擴增成功需要的血清HBV DNA濃度高于二片段法(p<0.05)。 2．兩種方法的連接和克隆效率：二片段方法要先連接，才能成為全基因組，二片段法80例血清中只有

7、5個樣本能成功連接，且重復(fù)性差。一片段本身為全基因組，不需要連接。分別用T-A和pBlueStript sk(-)方法進行全基因HBV DNA克隆，T—A克隆效率低，10個白色克隆，僅能得到1個成功插入3.2 Kb的重組質(zhì)粒，其余是空質(zhì)粒。SK(-)克隆效率較高，10個白色克隆均能成功插入3.2Kb，克隆效率達90％以上。 3．一片段方法的保真性和敏感性：保真性：對5份血清擴增和PCR產(chǎn)物擴增，比較一、二次產(chǎn)物的序列差異，發(fā)現(xiàn)僅

8、有18個堿基不同，總的差異率為1.13bp／kb。且這些差異中沒有發(fā)現(xiàn)堿基替換，無缺失、插入等現(xiàn)象。橫向比較這些差異位點，沒有發(fā)現(xiàn)相同的差異位點。敏感性：我們的研究發(fā)現(xiàn)，大于10<'4>的重組質(zhì)粒DNA可以成功擴增，濃度低于該值的擴增效率很低。 4. 12例血清的基因分析結(jié)果：對12例用一片段法成功獲得的HBV全基因組DNA序列進行分析，發(fā)現(xiàn)C基因型占41.67％(5/12)，B基因型占50％(6/12)，B、C混合基因型占8.

9、33％(1/12)。6例(224，225，226，228，500，502號)血清型為adrq+；6例(227，229，230，23l，233，501號)血清型為adw2。同一血清型不同病毒株之間的序列同源性為97.5％-99.8％。不同血清型病毒株之間的序列同源性為90.6％-99.8％。由于500號為B、C混合型，與其他株的同源性為91.3％-99.8％。 結(jié)論 1.血清HBV DNA水平對兩種擴增方法的成功率有一定影

10、響，滴度高低是選擇合適PCR擴增方法的依據(jù)。 2.二片段方法的擴增效率較高，但連接成全基因組比較困難，且克隆效率較低，得到的序列不能反映來自同一個毒株。一片段法不需要連接，克隆效率較高，且保真性和敏感性均較高，但擴增標(biāo)本中需要較高的HBV DNA滴度。 3.本研究建立的一片段PCR法擴增HBV全基因組及SK-載體克隆的技術(shù)平臺，可用于HBV DNA滴度較高的樣本(最適合大于10<'4>拷貝/毫升的樣本)的全基因組擴增、克