hbv全基因組1.3倍體構(gòu)建新策略及初步應(yīng)用

1、重慶醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文HBV全基因組1.3倍體構(gòu)建新策略及初步應(yīng)用姓名：崔靜申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學(xué)指導(dǎo)教師：黃愛龍20090401重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文核載體p C D N A 3 ．1 中形成H B V 全基因組1 ．3 倍重組體。2 ．將上述2 個H B V 體外重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞株H e p G 2 中，5 天后收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞H B V 復(fù)制中間體D N A ，進(jìn)行S o u t h e mB

2、l o t 分析；用化學(xué)發(fā)光法檢測雜交結(jié)果。3 ．利用構(gòu)建好的2 個H B V ] ．3 倍外重組體做恩替卡韋藥敏實驗，將其轉(zhuǎn)染到H e p G 2 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后第二天選用0 、O ．5 、2 、1 0 、1 0 0 n r n o l ／L5 個濃度進(jìn)行給藥，每2 天給藥1 次，5 天后收集細(xì)胞用S o u t h e r n B l o t方法檢測藥敏結(jié)果。結(jié)果：1 ．成功構(gòu)建了2 株直接來源于患者血清病毒D N A 的H B V

3、全基因組1 - 3 倍重組體。2 ．將上述體外重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到H e p G 2 細(xì)胞，用S o u t h e r n B l o t 檢測出較強(qiáng)的復(fù)制中間體信號，結(jié)果表明這種方法的建立是成功的，可以直觀的反映H B V 復(fù)制中間體的形態(tài)，大小和含量，從而體現(xiàn)其復(fù)制能力的強(qiáng)弱。3 ．采用該策略對2 株H B V 重組體進(jìn)行恩替卡韋藥物敏感初步實驗，證實它們均對恩替卡韋敏感，有效抑制病毒復(fù)制濃度分別為：I C 5 0 —1 = 1 ．8

4、+ 0 ．3 4 n m o l ／L ，I C 5 0 —2 = 1 ．4 4 - 0 ．2 7 n m o l ／L 。結(jié)論：我們成功建立了一種新的策略，能夠?qū)⒉∪搜鍢颖局蟹蛛x的病毒構(gòu)建成H B V 全基因組1 ．3 倍體。本策略具有以下優(yōu)點：根據(jù)病毒r c D N A 區(qū)域重疊的自然結(jié)構(gòu)，采用重疊延伸P C R 技術(shù)得到H B V l ．3倍體，該方法避免了復(fù)雜的酶切連接過程，通用性好，適合于個體化研究，有良好的重復(fù)性。利用本策