一種新細(xì)菌Phenylobacterium zucineum的全基因組測序及初步分析.pdf

1、Phenylobacteriumzucineum是一種我們近期在一種腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的兼性胞內(nèi)寄生菌，不僅與目前已知的菌種均不相同，而且具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和潛在的重要意義。由于該菌寄生在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，而目前大多數(shù)胞內(nèi)寄生菌都是病原體，因此該菌很可能與致病性相關(guān)；由于該菌是兼性胞內(nèi)寄生菌，所以在胞內(nèi)和胞外的細(xì)菌生存形態(tài)不同，研究其侵入人宿主細(xì)胞的機(jī)制有著重要意義；由于本組的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，該菌的侵入方式為“拉鏈”方式，即通過表達(dá)一些表面

2、蛋白，并于真核細(xì)胞表面受體相互作用，該受體-配體的結(jié)合引起宿主細(xì)胞骨架發(fā)生重排、細(xì)胞膜延伸并包裹該菌，形成吞噬泡并侵入細(xì)胞，所以尋找其表達(dá)的蛋白以及受體-配體相互作用機(jī)制，是研究中的一個重點(diǎn)；由于目前尚未有類似特征的細(xì)菌發(fā)現(xiàn)，該菌的發(fā)現(xiàn)在具有開創(chuàng)新的同時(shí)又具有爭議性，所以需要尋找該菌潛在的一些不顯而易見的生物學(xué)意義是至關(guān)重要的。要解決上述問題，需要從整體上、根本上觀察該菌的實(shí)質(zhì)，從而對生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的方向提供一定的指向性，挖掘潛在意義。全基

3、因組測序是一個很好的根本方法，因?yàn)橥ㄟ^全基因組序列的獲得，可以預(yù)測重要基因和蛋白，了解其功能和可能機(jī)制，促進(jìn)潛在生物學(xué)意義的發(fā)掘。 細(xì)菌基因組的全基因組測序目前已經(jīng)是相當(dāng)成熟的技術(shù)，隨著美國能源部1994啟動微生物基因組計(jì)劃以來，2000后基因組測序技術(shù)的完善使得世界上細(xì)菌全基因組測序項(xiàng)目以平均每年近50％的增長。截至2006年5月，NCBI上已全基因組測序的細(xì)菌已達(dá)343種(株)。 細(xì)菌基因組測序帶來的意義和應(yīng)用相當(dāng)廣

4、闊。在研究病原菌的致病性與疾病的預(yù)防和治療方面，通過全基因組測序可以鑒定致病相關(guān)基因、開發(fā)和研究疫苗、開發(fā)新型抗生素等；在生物技術(shù)的應(yīng)用方面，從抗輻射到氮源利用，從生物降解到耐熱酶開發(fā)帶來PCR技術(shù)的誕生，從而引發(fā)分子生物學(xué)的一場革命；在研究微生物的進(jìn)化方面，由于細(xì)菌間，甚至原核生物間，存在廣泛的水平基因轉(zhuǎn)移，所以，單個基因的進(jìn)化并不等同于物種的進(jìn)化，通過全基因組測序，可以研究進(jìn)化關(guān)系。 本文利用“全基因組霰彈法”(whole-

5、genome-shotgun)對P.zucineum進(jìn)行了全基因組測序和分析。文庫構(gòu)建階段，以pUC18為載體構(gòu)建了2.0-2.5Kb、2.5-3.0Kb、3-4Kb三種大小片段的DNA文庫。測序階段，在PCR雙脫氧法的基礎(chǔ)上，結(jié)合P.zucineum高GC的特征，通過加入甜菜堿、提高退火溫度和延伸時(shí)間等方法優(yōu)化測序反應(yīng)；為提高測序質(zhì)量，還對不同大小片段的庫采用不同的染料和測序儀。在拼接階段，借助于計(jì)算機(jī)Phred-Phrap-Cons

6、ed軟件包對大規(guī)模的測序片段進(jìn)行識別和組裝，用圖論的方法得到一組序列的公有序列(Consensussequence)，最后對拼接結(jié)果修正得到若干序列重疊群(contigs)，通過finishing的“補(bǔ)洞”階段將contigs連接定位，從而得到全基因組序列。在注釋階段，采用國際通用的Glimmer軟件預(yù)測開放閱讀框(ORF)，用blast對ORF進(jìn)行NCBI的非冗余數(shù)據(jù)庫的同源性檢索，以預(yù)測每個編碼序列(CDS)的功能。 測序得

7、到有效反應(yīng)66，540個(PhredQ20，大于50bp)，所測數(shù)據(jù)總長17.8Mb，冗余度為4×。最后結(jié)果顯示，P.zucineum基因組大小為4，379，231bp，由一個大小為3，996，255bp的環(huán)狀染色體和一個大小為382，976bp的質(zhì)粒組成。初步預(yù)測環(huán)狀染色體包含5，029個開放閱讀框(OpenReadingFrame，ORF)，其中2，483個ORF(49.4％)與已知功能蛋白的序列同源，1，626個ORF(32.3％

8、)與已知的假定蛋白的序列同源，其余920個ORF(18.3％)功能未知；質(zhì)粒包含512個預(yù)測ORF。大量功能未知的序列提示著新功能和新基因存在的可能。另外，在P/zucineum基因組可見明顯的GC分布不對稱(GCskew)，這是僅存在于原核生物基因組中的特點(diǎn)，即基因組的先導(dǎo)鏈和后隨鏈內(nèi)存在G與C或A與T分布的不對稱(GCskew或ATskew)，先導(dǎo)鏈的G大于后隨鏈的C。 P.zucineum基因組的一個顯著特征是高GC含量，

9、達(dá)71.10％，位于已全基因組測序的343種細(xì)菌基因組中的第四位。而另幾種高GC的細(xì)菌大多屬于放線菌綱。由于放線菌綱的細(xì)菌最重要的作用是可以產(chǎn)生、提煉抗菌素，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的2000多中抗菌素中，大約有56％是由放線菌產(chǎn)生的，同時(shí)由于放線菌同時(shí)兼有細(xì)菌和真菌的特征，從生物進(jìn)化的角度看，它還是屬于介于細(xì)菌與真菌之間的過渡類型。P.zucineum基因組的高GC含量不僅預(yù)示著復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，而且可以進(jìn)一步探求該菌與放線菌之間在高GC含量

10、上的潛在關(guān)系。 在通過直系同源簇方法，從同一簇中的已知基因注釋未知基因的功能的這種COG(clusteroforthologousgroup)中，目前已有25類，P.zucineum基因組含有其中的20種，并以未知功能的COG最多。但由于P.zucineum的兼性胞內(nèi)寄生菌的特征和“拉鏈”是侵入細(xì)胞的特性，在這20類COG中尤以與細(xì)胞壁/膜/包膜合成相關(guān)、細(xì)胞周期/細(xì)胞分裂/染色體分型相關(guān)、信號傳導(dǎo)機(jī)制相關(guān)、胞內(nèi)傳輸/分泌/小泡

11、傳輸相關(guān)的四類最有意義。首先選取細(xì)胞周期相關(guān)基因做初步分析。 在已全基因組測序的細(xì)菌基因組中，與P.zucineum同源性最高的是新月柄桿菌(C.crescentus)。新月柄桿菌是一種用于研究細(xì)胞分化、不對稱分裂、細(xì)胞周期調(diào)控的單細(xì)胞模式生物，單個菌細(xì)胞可分裂成兩個不同類型的細(xì)胞，與病原體有許多共同的基因。其中的CtrA基因是新月柄桿菌中控制細(xì)胞周期的主調(diào)控基因，可以控制四分之一的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的多個

12、過程；CtrA具有細(xì)菌生存必須的并具有轉(zhuǎn)錄的自我調(diào)控能力，編碼一種二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-componentsignal-transductionsystem)關(guān)鍵應(yīng)答調(diào)控子。二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)首先感應(yīng)外界環(huán)境的變化，繼而把信息傳遞給內(nèi)部系統(tǒng)，在病原菌對宿主的識別和侵襲、進(jìn)一步的致病或共生等過程中起著非常重要的作用。在P.zucineum中找到了CtrA與同源性高達(dá)93％的序列，命名為CtrZ。通過兩者調(diào)控的基因的比對，新月柄桿菌中Ct

13、rA直接控制的45個調(diào)控細(xì)胞周期的基因中有34個在P.zucineum中找到了高同源性序列，提示CtrZ有著和CtrA相似或相同的功能；通過以上分析的導(dǎo)向，采用將P.zucineum的CtrZ基因?qū)胄略卤鷹U菌的CtrA缺陷株的方法驗(yàn)證，導(dǎo)入CtrZ后的菌株能夠恢復(fù)野生新月柄桿菌的特性。結(jié)果提示，CtrZ基因能夠完全替代CtrA的功能，在P.zucineum的生長分裂過程中發(fā)揮重要的作用，為調(diào)控自身的生長繁殖以建立長期性胞內(nèi)寄生提供基礎(chǔ)