基于定點(diǎn)切除和COLD-PCR技術(shù)對(duì)基因損傷的檢測(cè).pdf

1、DNA損傷是在基因復(fù)制過(guò)程中導(dǎo)致的基因核苷酸序列的改變，同時(shí)導(dǎo)致遺傳特征的變化。研究表明，許多腫瘤癌癥的發(fā)生與基因損傷有著重要的聯(lián)系。目前已經(jīng)有一些對(duì)DNA損傷的檢測(cè)和修復(fù)技術(shù)的研究，對(duì)分子診斷有著一定的輔助作用。
　　COLD-PCR作為PCR的一種新模式，能夠在不改變常規(guī)PCR反應(yīng)所用試劑和儀器的情況下選擇性的對(duì)損傷和突變的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，起到對(duì)目的基因特異性富集的作用。
　　本研究通過(guò)對(duì)損傷基因的定點(diǎn)切除和修復(fù)，結(jié)合

2、COLD-PCR的檢測(cè)手段，建立一種對(duì)DNA損傷進(jìn)行檢測(cè)的新方法，長(zhǎng)度為200bp的DNA序列發(fā)生單堿基變化時(shí)其Tm值會(huì)產(chǎn)生0.5-2.0℃的變化。在對(duì)含有損傷的DNA寡核苷酸鏈進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在堿基切除修復(fù)后進(jìn)行COLD-PCR實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增的結(jié)果中可以顯示出該方法對(duì)于基因損傷檢測(cè)的效果，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)不同損傷基因個(gè)數(shù)的檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，降低目標(biāo)鏈中損傷基因相對(duì)于正常基因的比例，達(dá)到對(duì)損傷基因0.01％的檢測(cè)豐度。并且降低修

3、復(fù)酶的使用濃度，基于本實(shí)驗(yàn)的方法相對(duì)于報(bào)道過(guò)的其他方法體現(xiàn)出修復(fù)酶靈敏性的優(yōu)勢(shì)。
　　將該方法應(yīng)用于細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)實(shí)際細(xì)胞樣品中DNA損傷的檢測(cè)，且能夠?qū)Σ煌潭鹊膿p傷加以對(duì)比和區(qū)分。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)不同的活性氧物種能夠引起DNA的氧化損傷，可能作為導(dǎo)致癌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷從而對(duì)癌癥的治療提供一個(gè)新的潛在途徑。
　　本文建立的將定點(diǎn)切除技術(shù)和COLD-PCR結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因損傷的檢測(cè)，使用常見(jiàn)的檢測(cè)設(shè)備、操作相對(duì)簡(jiǎn)單，