多重PCR同步檢測(cè)MDV、APV和EDSV的技術(shù)研究.pdf

1、家禽養(yǎng)殖在我國具有悠久的歷史，隨著我國經(jīng)濟(jì)快速的發(fā)展，養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展規(guī)模與速度與日俱增，而制約其發(fā)展的主要難題是禽病，尤其是病毒性疾病。其中APV、MDV和EDSV是三種雞的B類傳染性疾病。通常，用于檢測(cè)病原體的主要方法有病毒的分離與鑒定、血清學(xué)鑒定以及PCR方法等。本文所要研究的多重PCR方法雖與常規(guī)PCR原理相同，但可以用于多種病毒的檢測(cè)，且與常規(guī)單一PCR一樣靈敏，是一種快速、有效的檢測(cè)方法，在病毒檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用市場(chǎng)。

2、>　　本研究利用DF-1雞胚成纖維細(xì)胞分別增殖了MDV、APV和EDSV，并利用異硫氰酸胍法提取病毒DNA，然后根據(jù)三種DNA序列分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，并將擴(kuò)增的片段克隆到pMD18-T載體中，以此建立了可同時(shí)檢測(cè)三種病毒的多重PCR方法，并優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)條件，最終確定了多重PCR反應(yīng)體系為20μL:0.2μL GoTaq Flexi DNA polymerase(5U/μL),4μL5×GoTaq Flexi buffer,

3、0.4μL dNTP(10mM),2.4μLMgCl2(25mM),APV-F/R0.4μL,MDV-F/R0.4μL,EDSV-F/R0.2μL，模板各1μL，滅菌水8.0μL;反應(yīng)程序?yàn)?94℃，5min;94℃，30s，54℃，30s，72℃，30s，循環(huán)40次;最后72℃，10min。
　　利用優(yōu)化后的多重PCR方法分別檢測(cè)了MDV、APV、EDSV以及任意組合，反應(yīng)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，還檢測(cè)了其他對(duì)禽類危害也較大的病毒，

4、如NDV、AIV、ALV、IBDV和IBV，均無擴(kuò)增片段，說明該方法具有較強(qiáng)的特異性。利用構(gòu)建的陽性克隆質(zhì)粒，研究了多重PCR檢測(cè)的靈敏度，多重PCR檢測(cè)APV的靈敏度為103copies/μL，檢測(cè)MDV和EDSV的靈敏度同為104copies/μL。并且討論了多重PCR與單一PCR檢測(cè)一種病毒的靈敏度以及多重PCR中另一種病毒對(duì)檢測(cè)該病毒靈敏度的影響。
　　利用建立的多重PCR方法檢測(cè)了30份從本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)收集的禽糞便樣，包括