一種以armored RNA作為報(bào)告基團(tuán)超靈敏的實(shí)時(shí)免疫RT-PCR方法的建立.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒所含的HCV部分核酸序列因被噬菌體衣殼蛋白包裹而具有耐核糖核酸酶(RNase)特性，使其替代酶免檢測(cè)中酶的顯色反應(yīng)，通過(guò)RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來(lái)提高對(duì)表面抗原(HBsAg)檢測(cè)的靈敏度。 研究方法：采用一種稱(chēng)為免疫-RT-PCR(IRTPCR)的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)報(bào)告系統(tǒng)對(duì)蛋白抗原進(jìn)行檢測(cè)，首先構(gòu)建原核表達(dá)

2、系統(tǒng)，表達(dá)內(nèi)含丙型肝炎病毒部分RNA序列的病毒樣顆粒，擬選用5′-UTR區(qū)作為MS<,2>噬菌體的包裝序列，引物5，端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。與用HindⅢ酶切的表達(dá)載體pNCCL1相連接，構(gòu)建一新的表達(dá)載體pNCCL1-HCV。在IPTG誘導(dǎo)下，衣殼蛋白會(huì)在攜帶有pET-MS<,2>-HCV的細(xì)菌中表達(dá)，并與reRNA組裝成病毒樣顆粒。在immuno-RT-PCR這個(gè)反應(yīng)體系中，包裹特定RNA的重組MS<,2>噬菌體顆粒與傳統(tǒng)ELIS

3、A中和特異抗體相連的報(bào)告基團(tuán)相似，同樣可以形成三明治夾心復(fù)合物，通過(guò)加熱使結(jié)合在固相的armored RNA裂解，釋放出特異的RNA，可以通過(guò)RT-PCR 進(jìn)行檢測(cè)。 研究結(jié)果：本研究得到的表達(dá)載體pET-MS<,2>-HCV及原核表達(dá)系統(tǒng)，可以作為構(gòu)建和制備耐RNase的HCV RNA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的平臺(tái)。通過(guò)RT-PCR可以提高免疫檢測(cè)的靈敏度。采用HBsAg作為三明治夾心中的待測(cè)抗原進(jìn)行實(shí)時(shí)免疫RT-PCR，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免

4、疫吸附實(shí)驗(yàn)相比，檢測(cè)的靈敏度提高了10000至100000倍?？梢杂貌煌腶rmored RNA采用多重實(shí)時(shí)RT-PCR 的方法同時(shí)檢測(cè)多種不同的靶抗原。這種方法可以作為一種新的超靈敏的免疫檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床診斷以及科研。 研究結(jié)論：成功構(gòu)建得到了質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)的包裝系統(tǒng)，經(jīng)原核表達(dá)得到了內(nèi)含HCV reRNA的病毒樣顆粒。成功的進(jìn)行了病毒樣顆粒與單克隆抗體的交聯(lián)，得到了能夠用于檢測(cè)的mAb-armored．RNA的結(jié)合物，從而使對(duì)H