HIV-1 RNA雙重實時熒光RT-PCR測定方法及其質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的系列研究.pdf

1、目的：建立新型的采用病毒樣顆粒作為內(nèi)質(zhì)控的HIV-RNA雙重實時熒光RT-PCR測定方法。制備無生物傳染危險性且耐RNase的HIV-1RNA檢測血清質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于臨床實驗室的室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評價工作。 方法： 一、HIV-RNA雙重實時熒光RT-PCR測定方法。 1. 從美國Los Alamos國家實驗室網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站下載所有已知HIV-1序列，采用DNAMAN和BioEdit軟件進(jìn)行比對，獲

2、取HIV-1序列的保守區(qū)域序列。再利用軟件Primer Express(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行實時熒光PCR引物和探針設(shè)計，并初步建立實時熒光PCR檢測體系。 2. 在上述的HIV-1 RNA實時熒光PCR檢測體系中，加入上面設(shè)計的不同的探針和引物，檢測本室構(gòu)建表達(dá)的內(nèi)含HIV-1 RNA的病毒樣顆粒和HIV-1感染患者樣本，篩選合適的引物和探針。初步確定了雙引物雙探針的檢測體系。根據(jù)雙引物雙探針體系構(gòu)建重組質(zhì)粒表達(dá)內(nèi)含HI

3、V-1 RNA內(nèi)標(biāo)的病毒樣顆粒，確定內(nèi)標(biāo)病毒樣顆粒在反應(yīng)體系中的最適濃度。通過不同添加劑的加入和不同酶混合物的調(diào)整優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)體系。 3.采用兩條不同的熒光探針和兩組引物進(jìn)行國際標(biāo)準(zhǔn)血清盤和HIV-1感染者血清標(biāo)本的HIV-1RNA檢測，并利用上述構(gòu)建表達(dá)的病毒樣顆粒作為內(nèi)標(biāo)以進(jìn)行假陰性質(zhì)控，考察了所建立方法的檢測靈敏度和特異性。比較了單探針和雙探針檢測方法在亞型檢測能力、檢測靈敏度和臨床樣本的檢測適用性。 二、

4、MS2包膜蛋白的原核表達(dá)、純化以及抗MS2蛋白多克隆抗體的制備及其與RNA的體外相互作用。 1.構(gòu)建表達(dá)包膜蛋白的pET<,42>-COAT、pGEX-4t-1-COAT原核表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3.1-COAT真核表達(dá)質(zhì)粒。原核表達(dá)重組MS2包膜蛋白。將重組蛋白利用親和柱進(jìn)行純化，純化后的包膜蛋白進(jìn)行尿素梯度透析。 2.分別采用原核表達(dá)重組蛋白免疫1號和3號兩只家兔、采用真核質(zhì)粒DNA疫2號和4號兩只家兔，制備抗MS2蛋

5、白的多克隆抗體。 3.配制體外包裝緩沖液，加入包膜蛋白與體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子，加入適量RNA酶抑制劑。4℃過夜，電泳觀察遷移率變動情況。 三、無生物傳染危險性HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和室間質(zhì)量評價應(yīng)用的研究。 1.無生物傳染性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大量原核表達(dá)，采用兩次超速離心進(jìn)行純化，獲得大量HIV-1病毒樣顆粒。 2.研究HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在3

6、7℃、室溫、4℃、-20℃以及-70℃至室溫反復(fù)凍融5次的樣本穩(wěn)定性。同時研究質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性，并采用匹基公司HIV-1核酸檢測試劑盒和COBAS Ampicor HIV-1 1.5 Motlitor試劑與HIV-1 RNA國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比對定值。 3.調(diào)查開展HIV-1 RNA檢測的實驗室，每個實驗室發(fā)放20份樣本同時附帶相同的操作說明及結(jié)果報表，開展臨床實驗室室間質(zhì)量評價。 結(jié)果： 一、HIV-1

7、RNA雙重實時熒光RT-PCR測定方法通過比對設(shè)計了10對引物探針，經(jīng)過篩選建立了雙引物雙探針體系。采用1000拷貝/ml的病毒樣顆粒作為內(nèi)部假陰性質(zhì)控，建立的雙特異探針檢測HIV-1實時熒光RT—PCR方法的靈敏度為125IU/ml，和單探針方法比較不存在大的差別；在檢測HTV-1陰性樣本時具有100％的特異性。和單探針方法比較，雙特異探針檢測HIV一1實時熒光RT-PCR方法在HIV-1亞型檢測中能檢測到M族的所有亞型以及O族；雙特

8、異探針檢測HIV-1實時熒光RT-PCR檢測體系檢測中國藥品生物制品檢定所提供的9株國內(nèi)流行株B、C、CRF01-AE、CRF07-BC、CRF08-BC的分型血清時均能檢出；在對60份臨床樣本的檢測中，單探針方法只能檢出39份，而雙探針方法能檢出50份(10份檢測陰性的樣本用COBAS檢測證明為陰性)。 二、MS2包膜蛋白的基因工程表達(dá)純化、抗MS2蛋白多克隆抗體的制備及其與RNA的體外相互作用完成了MS2包膜蛋白的原核表達(dá)和

9、純化。通過質(zhì)粒免疫和重組蛋白免疫的方法獲得了抗MS2包膜蛋白的多克隆抗體，1和3兩只家兔血清在稀釋1280000倍后仍然可以與重組MS2包膜蛋白反應(yīng)，而2和4兩只家兔血清只能在8000倍左右稀釋后呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。從RNA遷移率改變實驗證明了包膜蛋白可以和包裝位點具有特異性相互作用，但經(jīng)過RNaseA的消化后RNA條帶消失，說明了RNA和包膜蛋白的在體外發(fā)生了作用但未能形成完整的病毒樣顆粒。 三、無生物傳染危險性HIV-1 RNA測

10、定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和室間質(zhì)量評價應(yīng)用的研究無生物傳染危險性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在37℃、室溫、-200℃以及2-8℃保存情況下其性能并無明顯改變。在室溫條件下能穩(wěn)定3周：在37℃條件下能穩(wěn)定10天；-20℃以及2-8℃保存情況下能穩(wěn)定4周以上；反復(fù)凍融5次對無生物傳染危險性的HIV-1核酸檢測參考品沒有明顯影響：無生物傳染危險性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，適合臨床使用和開展臨床實驗室室間

11、質(zhì)量評價，從而保證臨床檢測質(zhì)量。病原體核酸檢測的主要問題在于低濃度樣本的檢測。病原體核酸檢測質(zhì)量保證還需要進(jìn)一步做好室內(nèi)質(zhì)控和參加室問質(zhì)量評價來進(jìn)行保證。 結(jié)論： 建立的雙引物雙特異探針檢測HIV-1實時熒光RT-PCR方法具有很高的檢測靈敏度以及HIV-1亞型的檢測能力。在對臨床樣本的檢測中證明具有很好的臨床適用性。因此，該方法具有良好的應(yīng)用前景。 無生物傳染危險性的HIV-1 RNA測定質(zhì)控物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性