內(nèi)含HCV RNA部分核酸序列的病毒樣顆粒的構(gòu)建及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型檢測方法的系列研究.pdf

1、目的: 構(gòu)建無生物傳染危險(xiǎn)性且耐RNase的HCV-RNA 1b、2a和6型病毒樣顆粒。將病毒樣顆粒用于丙型肝炎病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本的制備，研究其適用性。建立HCV-RNA實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型(1b、2a和6型)檢測方法。 方法: 一、內(nèi)含HCV RNA部分核酸序列的病毒樣顆粒的構(gòu)建將定量檢測試劑盒所檢測的區(qū)域HCV 5’UTR區(qū)和分型檢測NS5b區(qū)進(jìn)行overlap連接，并且引入酶切位點(diǎn)。PC

2、R產(chǎn)物進(jìn)行T載體克隆后用限制性內(nèi)切酶酶切獲得所需要的目的片段，與用酶切后的表達(dá)載體相連，構(gòu)建一新的表達(dá)載體。在IPTG誘導(dǎo)下，組裝成病毒樣顆粒，并驗(yàn)證包裝的核酸為HCV reRNA。 二、病毒樣顆粒在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究及室間質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用靶值的確定：與國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同時(shí)檢測，多點(diǎn)比對(duì)定值。 穩(wěn)定性的研究方法：將上述三種不同倍比稀釋的質(zhì)控物置于4℃(對(duì)照)、-20℃、室溫、37℃、-70℃及-70℃/室溫反復(fù)凍融3次的條件下保

3、存不同時(shí)間觀察其穩(wěn)定性。 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)方法：向全國開展HCV RNA檢測的實(shí)驗(yàn)室發(fā)放5份樣本。所有發(fā)放的陽性樣本的定量結(jié)果根據(jù)一級(jí)定量標(biāo)準(zhǔn)系列確定，對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 三、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型檢測方法檢索已知HCV 1b、2a和6型序列，采用BioEdit軟件進(jìn)行比對(duì)，獲取HCV 1b、2a和6型序列的保守區(qū)域序列。再利用軟件Primer Express 3.0進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針設(shè)計(jì)，初步建立實(shí)時(shí)熒光

4、PCR檢測體系。 結(jié)果: 一、內(nèi)含HCV RNA部分核酸序列的病毒樣顆粒的構(gòu)建成功構(gòu)建了含有HCV 5’UTR區(qū)和NS5b區(qū)的三種基因型重組原核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到BL21-DE3感受態(tài)細(xì)菌中，得到了可模擬臨床樣本的HCV RNA病毒樣顆粒。 二、質(zhì)控物的穩(wěn)定性研究以及應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室的PCR檢測室間質(zhì)量評(píng)價(jià)采用三種方法分別對(duì)VLPs定值，根據(jù)系列國家標(biāo)準(zhǔn)品含量，得到待測樣本的濃度。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中將檢測組與對(duì)照組(

5、4℃)數(shù)據(jù)分別作t檢驗(yàn)，結(jié)果表明檢驗(yàn)組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，整體定量結(jié)果與靶值接近，但是不同基因型樣本的符合率有所不同。此外，不同試劑和不同儀器檢測樣本的結(jié)果也有差異。 三、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分型檢測方法通過序列比對(duì)設(shè)計(jì)了三種HCV基因型特異的探針和引物，建立的基因型特異探針和引物基本能檢測出已構(gòu)建的HCV三種基因型的病毒樣顆粒。 結(jié)論: 建立了三種不同基因型的病