沙門(mén)菌反向線性探針雜交檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、沙門(mén)菌遍布于世界各地，是一種人獸共患病病菌。在世界范圍內(nèi)，沙門(mén)菌食物中毒常占首位或第二位。沙門(mén)菌感染也是影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的主要因素之一。隨著多重耐藥菌株的陸續(xù)產(chǎn)生，及時(shí)檢測(cè)出沙門(mén)菌，是有效預(yù)防沙門(mén)菌傳播，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。因此，開(kāi)發(fā)出一種簡(jiǎn)便、快速的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門(mén)菌檢測(cè)技術(shù)具有很大的應(yīng)用價(jià)值。反向線性探針雜交方法(RLPH)能夠特異、靈敏地?cái)U(kuò)增目的基因，具有簡(jiǎn)便、快速、可靠及造價(jià)低等特點(diǎn)，能夠滿足這一

2、要求。
　　本研究確定了沙門(mén)菌的RLPH檢測(cè)方法，并制備了沙門(mén)菌檢測(cè)試紙條。針對(duì)沙門(mén)菌特異的argT基因設(shè)計(jì)了生物素標(biāo)記上游引物5'端的1對(duì)引物，以沙門(mén)菌DNA為模板，PCR擴(kuò)增出496bp大小的片段，在PCR產(chǎn)物序列中選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)的兩條特異性探針，使此PCR產(chǎn)物與探針雜交反應(yīng)，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化，設(shè)定條件為PCR退火溫度為55℃，探針兩端添加15C，雜交時(shí)間為30 min，洗脫溫度為50℃，所加原液抗體為0.4μl

3、。利用設(shè)計(jì)的1對(duì)引物，分別對(duì)重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院分離、保藏的沙門(mén)菌以及金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有沙門(mén)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果呈陽(yáng)性。進(jìn)一步證明了argT基因的特異性，說(shuō)明argT基因可以作為檢測(cè)沙門(mén)菌的可靠靶序列。RLPH方法檢測(cè)靈敏高，PCR產(chǎn)物濃度為3 ng/μl時(shí)，可有效檢出。與其它常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病菌未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)NBT/BCIP堿