基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的新型超敏外周血HBV-DNA檢測方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、目的：基于微滴式數(shù)字PCR（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)，建立一種新型超敏的外周血乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）DNA檢測方法。評價其特異性與敏感性，并進(jìn)一步探討其在慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者長期監(jiān)測和治療過程中的應(yīng)用價值。
　　方法:
　　1、將載有HBV-DNA的質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，利

2、用ddPCR檢測各濃度梯度的HBV-DNA,來評價ddPCR的準(zhǔn)確性和敏感性。
　　2、收集慢性乙型肝炎患者的外周血，利用ddPCR和目前臨床常規(guī)使用的實時熒光定量PCR（real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法對比檢測，評價其與qRT-PCR相比的優(yōu)缺點。
　　3、將多個濃度梯度的 HBV-DNA質(zhì)控品血清，利用QIAamp UltraSens

3、Virus Kit高度濃縮提取后，再進(jìn)行ddPCR的檢測。通過HBV-DNA質(zhì)控品血清的模擬檢測，評價血清經(jīng)QIAamp UltraSens Virus Kit高度濃縮提取后的ddPCR檢測方法在各濃度梯度檢測的敏感性和準(zhǔn)確性，以及其重復(fù)測量的穩(wěn)定性。
　　4、將血清/血漿內(nèi)的HBV-DNA高度濃縮后的ddPCR檢測方法對臨床上抗病毒治療后外周血HBV-DNA低于檢測下限的CHB患者進(jìn)行隨訪檢查，評價其實際應(yīng)用的意義與價值。

4、>　　結(jié)果：
　　1、通過ddPCR檢測各濃度梯度的HBV-DNA質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)ddPCR有較高的敏感性，可檢測出單個拷貝的加入量。并且在各濃度的檢測與理論值有高度的可重復(fù)性和相關(guān)性（r=0.997，P=0.000）。在Bland-Altman分析中，可以見到ddPCR在各濃度的檢測與理論值相比呈現(xiàn)較高的準(zhǔn)確性和一致性，但當(dāng)加入量為單拷貝或大于105時，其變異性較大。
　　2、在檢測臨床標(biāo)本時，ddPCR和qRT-PCR的檢測結(jié)

5、果存在較高的一致性與相關(guān)性（r=0.931，P=0.000）。但在對低病毒載量樣本的檢測，ddPCR似乎呈現(xiàn)較高的敏感性。
　　3、在質(zhì)控品的檢測試驗中，QIAamp UltraSens Virus Kit高度濃縮后ddPCR檢測結(jié)果與質(zhì)控的理論值表現(xiàn)有良好的相關(guān)性（r=0.993，P=0.000）和一致性。對濃度為0.93log10 IU/mL的質(zhì)控品檢測中，可達(dá)到50％的檢出率。其他濃度梯度的質(zhì)控品的檢測，檢出率為100%。各

6、濃度梯度質(zhì)控品的重復(fù)試驗，結(jié)果呈現(xiàn)良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，未出現(xiàn)失控的表現(xiàn)。
　　4、利用高度濃縮后ddPCR的檢測方法，對臨床經(jīng)抗病毒治療轉(zhuǎn)陰的患者隨訪。我們發(fā)現(xiàn)無論HBeAg陽性或陰性組的病人中都會出現(xiàn)一部分病人存在或短或長的血清低病毒載量的狀態(tài)，以及出現(xiàn)少數(shù)轉(zhuǎn)陰后的低病毒載量的病毒突破，然而臨床上常規(guī)的病毒學(xué)檢測卻未能發(fā)現(xiàn)這些。
　　結(jié)論：
　　1、ddPCR對HBV-DNA的檢測呈現(xiàn)良好的準(zhǔn)確性和敏感性。