生物修復(fù)作用菌的競爭PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用.pdf

1、傳統(tǒng)的依靠培養(yǎng)基進行培養(yǎng)、分離、生化鑒定及計數(shù)的微生物研究方法，操作繁瑣、檢測周期長，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對微生物快速、特異、簡便、敏感且低耗的快速檢測及研究的要求。近年來，微生物的快速檢測和自動化研究進展迅速?？焖贆z測及其自動化已深入到分子水平，利用核酸雜交、抗原抗體反應(yīng)等對微生物進行分離、檢測、鑒定和計數(shù)，使微生物的檢測更為靈敏、快速、準(zhǔn)確、方便。 競爭PCR由Gilland等<'[1]>于1990年首先發(fā)明，其實質(zhì)是用合適的

2、內(nèi)對照模板(internal control template)與待測核酸(DNA或RNA)一起競爭參與PCR反應(yīng)，并通過電泳使擴增產(chǎn)物在凝膠上明顯分開，從而進一步進行定性或定量分析。競爭PCR能消除管間及樣本間的變異，定量范圍較廣，能夠檢測2倍的差異。且此方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，實驗條件容易達(dá)到。因此本論文選用競爭PCR建立了海水養(yǎng)殖環(huán)境生物修復(fù)作用細(xì)菌的快速定量檢測方法。 競爭PCR定量方法的關(guān)鍵是內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)設(shè)計成功與否直

3、接影響競爭PCR反應(yīng)。本文通過將細(xì)菌特定DNA片段經(jīng)雙酶切缺失中間一小片段，將余下的2個較大片段連接，并用相同的引物在相同條件下擴增連接產(chǎn)物，從而獲得截短的同源性片段，作為內(nèi)標(biāo)。制備時，將其純化后克隆于pMD18-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定，驗證無誤后作為競爭性模板內(nèi)對照。將內(nèi)標(biāo)模板按一定比例稀釋后分別與等體積細(xì)菌DNA進行PCR，結(jié)果表明目的DNA與競爭性DNA的擴增產(chǎn)物之間具有明顯的線性競爭關(guān)系，結(jié)合其他細(xì)菌計數(shù)方法，建立了

4、內(nèi)標(biāo)模板量與原樣品中細(xì)菌數(shù)量的線性方程。本實驗設(shè)計的特異性引物經(jīng)PCR擴增得到了與預(yù)期PCR產(chǎn)物大小相當(dāng)?shù)奶禺愋詶l帶且敏感性較好。本競爭PCR方法的靈敏度可達(dá)到10<'0.5>ng/μL，檢測時間從平板計數(shù)需花3-5天到只需2天即能完成，大大提高了檢測速度，節(jié)省了大量的時間和試劑，并且可以定量檢測特定的細(xì)菌。 在建立了競爭PCR定量檢測方法后，我們應(yīng)用此方法檢測了2006年冬季和2007年春季浙江象山港海灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)沉積環(huán)境中這

5、兩類菌的分布情況，五個區(qū)域分別為網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)、貝類養(yǎng)殖區(qū)、海帶養(yǎng)殖區(qū)、離網(wǎng)箱較近的對照區(qū)、離網(wǎng)箱較遠(yuǎn)的對照區(qū)。檢測結(jié)果表明，無論在春季樣品中還是冬季樣品中菌株Y都比菌株J<,3>多一個或兩個數(shù)量級；在五個區(qū)域中網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)菌量最大，春季樣品中J<,3>菌量為1.47×10<'4>個/g，Y菌量為4.59×10<'4>個/g；但同一區(qū)域春季與冬季相比，除離網(wǎng)箱較遠(yuǎn)的對照區(qū)外，同一區(qū)域J3菌春季比冬季要多出一個數(shù)量級。Y菌除了海帶養(yǎng)殖區(qū)可看出增