CHFR和Runx3基因表達(dá)及啟動子甲基化與胃癌病理生物學(xué)特征的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、目的： 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。與其他惡性腫瘤一樣，胃癌的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過程。這些基因主要是癌基因、抑癌基因及DNA錯配修復(fù)基因等。抑癌基因功能的丟失可以通過多種途徑，除基因突變和雜合性丟失外還與其啟動子發(fā)生甲基化修飾有關(guān)。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)催化下，以S-腺苷蛋氨酸(Sademetionine，SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移

2、到DNA特定堿基上去的過程。真核生物染色體DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。DNA異常甲基化可引起染色體結(jié)構(gòu)、DNA穩(wěn)定性的改變和基因表達(dá)異常，影響細(xì)胞的增殖和分化。真核生物DNA甲基化水平與腫瘤關(guān)系密切。啟動子區(qū)高甲基化能導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默，這是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵事件。新近研究證實(shí)，CHFR是重要的腫瘤抑制基因，其表達(dá)產(chǎn)物是Plk1的泛素化連接酶。Plk1調(diào)控cdc25和Weel激酶的磷酸化，在G2期進(jìn)入M期時(shí)控制cdc2激酶的活性

3、。而CHFR能引起Plk1泛素化和降解，阻斷細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂中前期。CHFR基因在人正常組織中普遍表達(dá)，在一些腫瘤中表現(xiàn)為失活或低表達(dá)，因而不能阻斷異常細(xì)胞通過G2期進(jìn)入有絲分裂中前期，從而導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖。另有研究證實(shí)，Runx3基因(runt-related transcription factor 3 gene)編碼的runx3蛋白是TGF-β信號通路下游的一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，TGF-β是多種細(xì)胞生長的有效抑制因子，TGF-β信號

4、轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的紊亂可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。 本研究采用MSP、RT-PCR、Westernblotting及免疫組化(IHC)技術(shù)，檢測人胃癌組織及其配對正常胃黏膜CHFR及Runx3基因的甲基化狀態(tài)、mRNA和蛋白的表達(dá)水平，觀察分析CHFR及Runx3基因異常甲基化與其mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)的關(guān)系，探討胃癌組織中CHFR及Runx3基因啟動子甲基化和mRNA表達(dá)異常與胃癌病理生物學(xué)特征的關(guān)系，為闡釋抑癌基因CHFR及Runx3

5、在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)理提供新的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料和方法： 1、研究對象 本實(shí)驗(yàn)研究對象收集2003-12至2004-05中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科及遼寧省腫瘤醫(yī)院外科手術(shù)切除胃癌常規(guī)病理組織標(biāo)本151例。另外，收集2007年3月至9月遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)切除之新鮮胃癌組織及其配對遠(yuǎn)端的正常胃粘膜組織(距胃癌灶邊緣>5cm處)標(biāo)本共36例，迅速置于液氮內(nèi)冷凍，然后儲存于-70℃冰箱中保存

6、待用。所有病例均經(jīng)病理檢查確定診斷，所有胃癌患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療。選擇胃癌和其配對正常胃粘膜組織資料完整的20個(gè)病例用于實(shí)驗(yàn)。 2、實(shí)驗(yàn)方法 (1)胃癌組織芯片制作 采用組織芯片制作儀(Microarrayer，BeecherInstruments，USA)制作組織芯片。構(gòu)建完成胃癌及其癌前病變的組織微陣列石蠟塊1、2、3、4和5(蠟塊1：含117個(gè)組織芯；蠟塊2：含109個(gè)組織芯；蠟塊3：含110個(gè)組織芯；

7、蠟塊4：含101個(gè)組織芯；蠟塊5：含124個(gè)組織芯)。將組織芯片蠟塊行連續(xù)切片，切片厚度為4μm，用于免疫組織化學(xué)染色的切片裱于經(jīng)0.1％多聚賴氨酸防脫片處理的載玻片上，60℃烤片1h，58℃中繼續(xù)烤片18h，常溫保存?zhèn)溆谩?(2)免疫組化染色檢測CHFR和mP53蛋白表達(dá) 采用Envision方法對胃癌及其癌前病變組織芯片進(jìn)行免疫組化染色。Immuno-Bridge＋試劑盒，鼠抗人CHFR單克隆抗體(工作濃度1:75)

8、和鼠抗人：P53單克隆抗體(即用型)分別購自Abnova公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有步驟依據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行，利用PBS(0.01mol/L，PH7.4)替代一抗作為陰性對照。 免疫組化染色結(jié)果判定：CHFR和mP53蛋白免疫染色陽性信號分別定位于細(xì)胞漿和胞核，呈棕黃色顆粒，每個(gè)標(biāo)本觀察2個(gè)有代表性的高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞確定陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比并取它們的平均值，陽性細(xì)胞數(shù)≤20％為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)

9、>20％為陽性(+)。 (3)RT-PCR法檢測CHFR和Runx3基因mRNA表達(dá) 采用TRIZOL試劑提取標(biāo)本總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以CHFR和Runx3基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以β-actinPCR為內(nèi)參照。 (4)MSP檢測CHFR和Runx3基因甲基化狀態(tài) 采用TIANampGenomic血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA。先用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，純

10、化DNA后，使用CHFR和Runx3基因甲基化及非甲基化引物進(jìn)行擴(kuò)增。 (5)WesternBlot檢測CHFR和Runx3基因編碼蛋白表達(dá) 組織以1:5比例加入裂解緩沖液提取組織蛋白；樣品(蛋白)濃度的定量采用考馬斯亮藍(lán)法；蛋白質(zhì)進(jìn)行12％濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；硝酸纖維素濾膜，轉(zhuǎn)膜2h；與一抗(CHFR工作濃度1:400，Runx3工作濃度1:300)室溫下孵育2h；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(工作濃度1:10

11、00)室溫孵育1h；免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECLReagent)顯示免疫反應(yīng)條帶；采用GEL-XR凝膠成像系統(tǒng)將將電泳結(jié)果成像；BANDSCAN5.0軟件系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，采用目的蛋白條帶光密度值與相應(yīng)β-tubulin光密度值的比值作為相對表達(dá)水平指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用(x)±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，組內(nèi)資料以構(gòu)成比描述，組間計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)(Fisher’精確概率法)和

12、計(jì)量資料t檢驗(yàn)，Spearman等級相關(guān)檢查。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、151例胃癌組織中CHFR基因編碼蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，有絲分裂前期檢查點(diǎn)CHFR基因表達(dá)下調(diào)或缺失在胃癌中是頻發(fā)事件?？赡軈⑴c胃癌的發(fā)生，其與女性、彌漫浸潤型胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系可能更為密切。 2、CHFR和Runx3基因在胃癌組織中的甲基化率均顯著高于其配對正常胃粘膜，提示CHFR和Run

13、x3基因異常甲基化可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展；胃癌組織中CHFR和Runx3基因啟動子甲基化是其mRNA及編碼蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失的主要原因。對二者的檢測可有助于胃癌的早期診斷。 3、胃癌組織中CHFR與Runx3mRNA異常表達(dá)無密切相關(guān)關(guān)系，但均與組織學(xué)分化程度有關(guān)，二者可能通過不同作用機(jī)制參與胃癌的組織學(xué)分化。Runx3mRNA表達(dá)下調(diào)或缺失與胃癌的侵襲深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，對客觀判斷胃癌患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。