NES1基因在眼瞼基底細(xì)胞癌中的表達(dá)及其外顯子3甲基化狀況的實驗研究.pdf

1、【研究目的】(1)研究在眼瞼基底細(xì)胞癌(Basal Cell Carcinoma，BCC)中NESl基因和蛋白的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與表型之間的關(guān)系，從基因和蛋自水平上研究NESl在BCC的發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以期判斷NESl基因是否能作為眼瞼腫瘤早期診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)記物；(2)研究NESl基因外顯子3的甲基化情況，以期找到NESl在眼瞼BCC中異常表達(dá)的可能機制，為眼瞼BCC的治療尋找新的靶點。 【研究方法】本實驗共分

2、兩大部分：第一部分，我們采用實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR)和免疫組化的方法檢測了NESl在31例眼瞼BCC中的基因表達(dá)和蛋白(human kallikrein 10，hklO)的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與表型之間的關(guān)系，我們采用Image-Pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化結(jié)果進行掃描，定量分析了hklO在不同組眼瞼BCC中表達(dá)；第二部分，采用甲基化特異性PCR(Methylafion

3、 Specific PCR，MSP)，研究了NESl外顯子3的甲基化情況，從不同實驗組別甲基化表達(dá)的情況，分析了NESl基因外顯子3異常甲基化與NESl基因異常表達(dá)之間的相關(guān)性，并把所有結(jié)果進行了統(tǒng)計分析。 【研究結(jié)果】(1)我們采用實時熒光定量PCR，建立了NESl基因在眼瞼BCC中表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)在所有正常眼瞼皮膚組織中，我們都檢測到了NESl mRNA的表達(dá)，但其較正常淚腺組織中NESl mRNA的表達(dá)相對較弱，二

4、者之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；(3)在31例眼瞼BCC中，我們檢測到4例(12.9％)高表達(dá)，18例(58.1％)低表達(dá)，9例(29.0％)表達(dá)缺失。眼瞼BCC中NESl的mRNA表達(dá)明顯下降，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；(4)眼瞼BCC原發(fā)組和復(fù)發(fā)組相比較，NESl的mRNA表達(dá)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但復(fù)發(fā)組具有較高的表達(dá)缺失率(60％)；(5)各組織學(xué)類型BCC之間NESl表達(dá)無顯著性差異，(

5、P>0.05)；5例硬化型BCC中，3例(60％)低表達(dá)，2例(40％)表達(dá)缺失，其NESl表達(dá)率相對較低；(6)免疫組化結(jié)果顯示，NESl的分泌性表達(dá)蛋白hk10主要表達(dá)在細(xì)胞漿中，呈棕黃色。在正常眼瞼上皮組織中，hk10主要分布在上皮各層的鱗狀上皮細(xì)胞胞漿中，靠近基底細(xì)胞層表達(dá)稍強，而在正常淚腺組織中，其高表達(dá)于導(dǎo)管和腺泡小葉的立方柱狀上皮細(xì)胞胞漿中，在導(dǎo)管中也可見其分泌的hk10表達(dá)；(7)BCC原發(fā)組與BCC復(fù)發(fā)組在平均光密度上

6、無顯著性差異(p>0.05)，在累積光密度(IOD)上，二者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，BCC原發(fā)組具有較強的表達(dá)；(8)通過甲基化特異性PCR(MSP)，我們檢測到，在20例正常眼瞼上皮標(biāo)本中無一例甲基化，在31例眼瞼BCC中有18例(58.06[％])檢測到甲基化，11例(35.48[％])無甲基化，2例(6.45[％])出現(xiàn)半甲基化(即出現(xiàn)雙帶)。其中26例原發(fā)性BCC中16例檢測有甲基化，5例復(fù)發(fā)性BCC中有4例出現(xiàn)了甲基化。原發(fā)組與

7、復(fù)發(fā)組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(X<;2>=0.624，P>0.05)；(9)在正常組和4例高表達(dá)的BCC中均未檢測到甲基化，9例表達(dá)缺失的BCC中有8例(88.89[％])檢測到甲基化，18例低表達(dá)的BCC中有10例(55.56[％])檢測到甲基化。后二者與前者比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。進行相關(guān)性分析，spearmancorrelation=-0.736,P<0.01，說明外顯子3的CpG島甲基化與NESl的異常表達(dá)有著密切

8、的相關(guān)性。 【結(jié)論】 (1)NESl在正常眼瞼上皮組織中高表達(dá)，但較正常淚腺上皮的表達(dá)低；(2)在眼瞼基底細(xì)胞癌(BCC)中，NESl明顯表達(dá)下調(diào)，其與眼瞼BCC的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系；(3)外顯子3的CpG島甲基化與NESl的異常表達(dá)有著密切的相關(guān)性。但是否是NESl表達(dá)下調(diào)的唯一機制，還需排除基因突變和雜合性缺失等基因結(jié)構(gòu)改變的影響，需要進一步的實驗研究來證實；(4)NESl陽性表達(dá)細(xì)胞的減少，可能在眼瞼BCC的復(fù)發(fā)中起