PTEN基因在喉鱗癌中的表達(dá)及其第5、第8外顯子突變分析.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文PTEN基因在喉鱗癌中的表達(dá)及其第5、第8外顯子突變分析姓名：白偉良申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：耳鼻咽喉指導(dǎo)教師：任重2003.2.1段長度為316bp；第8外顯子：游引物5’AGGACAAAATGTTTCACTTTTGGG一3’，下游引物5’ACATACATACAAGTCACCAACCC一3’，其擴(kuò)增產(chǎn)物為275bp。每259L擴(kuò)增體系中含4種dNTP各100pmoL，引物各25pmo|，DNA模板lng，lOx緩

2、沖液25pL，Taq聚合酶1u。第5外顯子反映條件如下：首次變性94℃3min，然后92℃60s，55。C45s，72。C20s，35個循環(huán)后，于72℃延伸7min；第8外顯子反映條件如下：首次變性94℃3rain，然后94℃45s，57℃60s，72℃60s，32個循環(huán)后，于72。C延伸7rain。SSCP：取109LPCR產(chǎn)物，加入變性載樣緩沖液f95％甲酰胺，10mmol／L乙二胺四乙酸(pH80)，005％溴酚藍(lán)，005％氰化二

3、f_『f苯腈藍(lán)，10mmol／LNaOH1109L混勻，96℃變性10rain，冰卜I驟冷，上樣行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳300V，3～4小時左右，直至溴酚藍(lán)接近凝膠底部。DNA銀染：剝膠，固定20分鐘，AgN03染色30min，然后顯色至帶型清晰為止，看片燈下觀察電泳情況，與jl三常喉組織帶型一致為系統(tǒng)正常對照，對與此相異的DNA帶型遷移率改變即為SSCP結(jié)果陽性。PCR產(chǎn)物直接測序法：在PCRSSCP篩選的陽性標(biāo)本行PCR擴(kuò)增

4、，純化后在上海聯(lián)合基因科技研究院進(jìn)行PCR產(chǎn)物直接測序，DNA自動測序儀為美國產(chǎn)ABl3700，序列與基兇庫WWWncbinlmnihgov正常序列比較，并應(yīng)用—wwwbios—oflnet／sms／indexhtml_軟件分析。為有顯著性意義)。統(tǒng)計學(xué)方法：U檢驗(P005，結(jié)果：49例標(biāo)本中13actinmRNA擴(kuò)增結(jié)果表明3actin全部陽性，PTEN基因RTPCR預(yù)期的目的基岡片段長度為136bp，PTEN基因有47例陽性，且與

5、預(yù)期片段大小相等，特異性高，但強(qiáng)度各不相同。正常喉粘膜PTEN基因rnRNA的高表達(dá)、中等表達(dá)率分別為778％，222％；聲門犁喉癌高、中、低表達(dá)率分別為454％，273％，273％；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的聲門上型喉癌高、中、低表達(dá)率分別為572％，214％，214％；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的』引]上型喉癌高、中、低及無表達(dá)率分別為267％，333％，267％，133％，聲『j型及聲門上型喉癌與正常喉組織相比，其mRNA表達(dá)下降，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的聲門卜