缺第4和5外顯子的IL-7剪接變異體蛋白表達及活性研究.pdf

1、研究背景：
　　機體多種細胞都能產(chǎn)生IL-7，其主要生物作用是參與機體的免疫調節(jié)；IL-7有多個剪接變異體，其生物活性的研究才剛剛開始。研究報道 IL-7具有強大的抗纖維化作用，其作用機制主要為通過激活 JAK1/STAT1信號通路上調 Smad7表達及下調TGF-β1的表達以阻斷TGF-β誘導膠原合成。IL-7δ4/5是I L-7缺第4和第5外顯子的剪接變異體，其生物學作用的研究才剛展開，其是否也影響肺纖維化的發(fā)生發(fā)展亦有待研究

2、。
　　研究目的：
　　本課題利用原核表達載體pET-21b表達I L-7δ4/5蛋白，包涵體經(jīng)溶解、復性、純化后，獲得復性的高純度的蛋白質，經(jīng)Western-blot鑒定后，采用TGF-β1和IL-7作為對照分析其對肺成纖維細胞MRC-5的影響，并初步探討其作用機制。
　　研究方法：
　　1.IL-7δ4/5蛋白的制備：以18-T-IL-7δ4/5（實驗室保存）作為模板進行亞克隆，在成功構建IL-7δ4/5原核

3、表達質粒pET-21b-IL-7δ4/5后，進行誘導劑誘導表達和蛋白質可溶性分析，進一步優(yōu)化其誘導濃度和誘導時間，以確定最佳參數(shù)。IL-7δ4/5蛋白包涵體經(jīng)溶解后，蛋白的復性用梯度透析法，純化用親和層析色譜法。純化后，以鼠抗人IL-7抗體和6×His單克隆抗體為一抗，分別對IL-7δ4/5蛋白進行Western Blot鑒定。
　　2.IL-7δ4/5蛋白對人胚肺成纖維細胞 MRC-5的影響：分別用 IL-7、IL-7δ4/5和

4、TGF-β1作用于M RC-5細胞，細胞增殖用MTT法檢測，colla ge nI、α-SMA蛋白表達用Western-blot法檢測。
　　結果：
　　1.IL-7δ4/5蛋白的誘導表達、復性及純化：重組表達質粒 p ET-21b-IL-7δ4/5構建成功。進行PCR檢測，擴增的目的片段約為345bp，和預期結果相符；測序分析發(fā)現(xiàn)：結果與GenBank中IL-7δ4/5基因序列完全一致。質粒轉染成功的陽性克隆進行培養(yǎng)和IP

5、TG誘導后，SDS-PAGE電泳證實其誘導表達成功。分離純化的包涵體進行溶解、稀釋與梯度透析后，IL-7δ4/5蛋白的復性效率達到45％，利用親合層析色譜法純化后，蛋白質的純度達到了95%以上，最后用Western Blot法進行證實。
　　2.IL-7δ4/5蛋白對MRC-5細胞的作用：TGF-β1、IL-7、IL-7δ4/5分別作用于體外培養(yǎng)的MRC-5細胞，結果TGF-β1能明顯促進細胞的增殖（P<0.01），明顯誘導細胞c