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文檔簡(jiǎn)介
1、RNA可變剪接是真核生物基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié),可極大的增加蛋白質(zhì)的多樣性與生物體的復(fù)雜性,RNA的互斥可變剪接是其中一種最復(fù)雜的類型,它的機(jī)制目前尚無(wú)定論。RNA互斥可變剪接即在基因轉(zhuǎn)錄生成的前體mRNA中,一組可變剪接外顯子(兩個(gè)及以上)連續(xù)排列在一起,但在成熟的mRNA中只有其中的一個(gè)成員能被選擇剪接保留下來(lái)。RNA互斥可變剪接很早就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),但直至目前,科研人員對(duì)互斥可變剪接的調(diào)控機(jī)制仍知之甚少。模式生物黑腹果蠅(D.m
2、elanogaster)Dscam基因是互斥可變剪接研究中最著名的基因,該基因含有四組互斥外顯子,可以通過(guò)互斥可變剪接形成38016種不同的異構(gòu)體。盡管RNA互斥可變剪調(diào)控機(jī)制存在多種假說(shuō),并且科學(xué)家Gravely在2005年通過(guò)生物信息學(xué)方法提出了錨定位點(diǎn)-選擇序列模型,解釋了其中一組互斥外顯子的調(diào)控模型,然而,這個(gè)機(jī)制沒(méi)有在其它的的互斥外顯子剪接中發(fā)現(xiàn),不能很好的解釋該基因如何巧妙的產(chǎn)生如此多的可變剪接形式。
本研究利用生
3、物信息學(xué)方法深入分析果蠅20個(gè)物種Dscam基因的4號(hào)互斥可變外顯子序列。分析結(jié)果顯示,在可變外顯子4相關(guān)的內(nèi)含子中存在一些保守的序列元件,類似于Gravely所提出的錨定位點(diǎn)-選擇序列剪接機(jī)制模型,選擇序列位于每個(gè)互斥外顯子后面的內(nèi)含子中,錨定位點(diǎn)位于最后面的內(nèi)含子中,選擇序列和錨定位點(diǎn)反向互補(bǔ)形成莖環(huán)狀的二級(jí)結(jié)構(gòu),選擇序列競(jìng)爭(zhēng)配對(duì)錨定位點(diǎn)從而指導(dǎo)外顯子4的互斥可變剪接。不同果蠅物種的這些保守選擇序列和錨定位點(diǎn)形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有驚人的
4、保守性,提示這些序列保守的元件很可能指導(dǎo)并左右著互斥外顯子4的可變剪接情況。隨后開(kāi)展的一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)證實(shí)了我們對(duì)這些特定序列功能的猜想。此外,利用生物信息學(xué)手段我們發(fā)現(xiàn),在20個(gè)果蠅物種的Dscam基因外顯子6的錨定位點(diǎn)前面存在一段復(fù)雜的內(nèi)含子序列,它可以形成六個(gè)串聯(lián)排列的緊湊RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu),并且該相似的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在其它昆蟲(chóng)物種中具有較好的進(jìn)化保守性。我們由此推測(cè)這段內(nèi)含子序列是調(diào)控果蠅Dscam基因外顯子6互斥可變剪接的
5、重要元件。在此科學(xué)設(shè)想的基礎(chǔ)上,我們利用果蠅永生化S2細(xì)胞株對(duì)Dscam基因表達(dá)展開(kāi)了一些實(shí)驗(yàn)研究:通過(guò)破壞、互補(bǔ)突變、插入、刪除部分保守序列等手段我們檢測(cè)了該基因互斥外顯子6的可變剪接情況。所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明:這段可形成六個(gè)莖環(huán)狀的RNA配對(duì)結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子序列參與了果蠅Dscam基因外顯子6的各互斥外顯子的可變剪接,該保守RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在互斥可變剪接中起到了極重要的調(diào)控作用。
本研究利用EMSA實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)果蠅14-3-3ζ
6、基因的互斥可變外顯子序列、與其內(nèi)含子序列以及果蠅Dscam外顯子6前面的類增強(qiáng)子莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列與RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合能力進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示互斥外顯子序列傾向于結(jié)合SR蛋白、其內(nèi)含子序列傾向于結(jié)合hnRNP蛋白、類增強(qiáng)子序列傾向于結(jié)合SR蛋白。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明除了RNA形成的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu),一些RNA剪接蛋白可與RNA的序列元件特異結(jié)合共同參與RNA互斥可變外顯子的可變剪接,后續(xù)實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。綜上所述,我們對(duì)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)在模式生物果蠅D
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