胃癌細胞系中死亡受體甲基化的研究.pdf

1、胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，其死亡率居當今世界癌癥致死率的第二位。在中國，胃癌的致死率更是位列各種癌癥之首。與其它惡性腫瘤相似，胃癌也是多基因遺傳以及表觀遺傳的改變共同作用的結果。胃癌很多是從慢性胃粘膜病變演變而來，而其演變的機制依然不明。
　　人類基因組中具有兩種遺傳學信息:即傳統(tǒng)意義上的遺傳學信息提供了功能性蛋白質合成所需要的模板;而表遺傳學的信息則提供了這些遺傳學信息指令所執(zhí)行的特定時間，地點以及方式。對惡性腫瘤的多年研究

2、使人們認識到幾乎所有人類腫瘤不僅僅是由基因結果改變引起的，而表觀遺傳學的異常同樣起著舉足輕重的作用。表觀遺傳學改變主要包括DNA甲基化改變和組蛋白修飾，這兩種調控模式本身及之間的相互作用網絡可導致印記丟失，染色質重塑，非必需重復序列的轉錄、基因的異?；罨约耙职┗虻漠惓３聊?。表觀遺傳學的研究為進一步了解腫瘤的各種特性，優(yōu)化腫瘤的早期診斷，改善腫瘤的預后提供了嶄新的策略。
　　DNA甲基化所致基因表觀遺傳學轉錄失活已經成為腫瘤表

3、觀基因組學研究的重點內容?；蚪M水平上研究DNA甲基化模式不僅對于腫瘤疾病的診斷、治療和預后判斷具有重要的實用價值，而且腫瘤細胞CpG島甲基化所致相關基因的表觀遺傳學轉錄沉默也為Knudson“二次打擊(two-hit)”經典假說做出了重要的補充。
　　死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因超家族，其胞外區(qū)有一段富含半胱氨酸的區(qū)域，而胞質區(qū)具有同源氨基酸殘基構成的結構域，后者具有蛋白水解功能，稱作死亡結構域(death do

4、main，DD)。通過死亡結構域，死亡信號得以進一步傳遞，最終啟動凋亡的發(fā)生。目前已知的死亡受體有5種，分別是TNFR1（又稱CD120a或p55），CD95（又稱FAS/Apo-1），DR3（又稱Wsl—1/Ap03/ TRAMP)，DR4，DR5。前三種受體的配體分別是TNF，CD95L(FasL)，Apo-3L，而DR4和DR5的配體均為TRAIL(APO-2L)。與前三種受體啟動的凋亡通路不同，DR4和DR5具有其自身的鮮明特點

5、。體內外實驗表明，TRAIL與死亡受體結合可選擇性的誘導多種腫瘤細胞凋亡，而對大多數正常細胞無明顯的殺傷作用121。這一特性使其優(yōu)于TNF配體家族的其它成員，成為腫瘤治療的新動力。
　　目前，有多項研究表明DR4和DR5在多種腫瘤細胞中存在低表達的現(xiàn)象，而且其表達水平的下降可能與其基因的啟動子區(qū)甲基化相關。但是，目前在胃癌細胞中尚沒有對DR4和DR5甲基化的詳盡研究。因此，本研究以多種人胃癌細胞系為研究對象，重點研究DR4和DR5

6、在胃癌細胞中的表達水平以及甲基化狀態(tài)，并通過體內體外實驗來研究去甲基化藥物5-Aza-CdR對其甲基化的影響，從而為胃癌發(fā)生機制的研究以及胃癌的治療探索新的思路。
　　方法:
　　1、常規(guī)培養(yǎng)4株胃癌細胞株，分別AGS，SGC7901，MKN28，MGC803。
　　2、取兩例胃大部切除術后的胃正常上皮組織作為對照。
　　3、RT-PCR方法檢測胃癌細胞株內DR4和DR5的RNA表達水平。
　　4、West

7、ern blot檢測胃癌細胞株內DR4和DR5的蛋白表達水平。
　　5、 MS-PCR檢測胃癌細胞株內DR4和DR5啟動子區(qū)甲基化水平。
　　6、RT-PCR方法檢測5-Aza-CdR處理后的胃癌細胞株內DR4和DR5的RNA表達水平。
　　7、Western blot方法檢測5-Aza-CdR處理后的胃癌細胞株內DR4和DR5的RNA表達水平。
　　8、 MS-PCR檢測5-Aza-CdR處理后的胃癌細胞株內D

8、R4和DR5啟動子區(qū)甲基化水平。
　　9、建立胃癌裸鼠移植瘤模型。
　　10、測定5-Aza-CdR處理后的胃癌裸鼠移植瘤生長曲線。
　　11、RT-PCR方法檢測5-Aza-CdR處理后的胃癌裸鼠移植瘤內DR4和DR5的 RNA表達水平。
　　12、Western blot方法檢測5-Aza-CdR處理后的胃癌裸鼠移植瘤內DR4和DR5的RNA表達水平。
　　13、MS-PCR檢測5-Aza-CdR處理后

9、的胃癌裸鼠抑制瘤內DR4和DR5啟動子區(qū)甲基化水平。
　　14、統(tǒng)計學分析各實驗數據。
　　結果:
　　1、胃癌細胞中DR4和DR5在mRNA水平存在表達水平下調。在MKN28，MGC803，AGS以及SGC7901細胞系中，DR4的mRNA表達水平經統(tǒng)計分析均低于對照組(P＜0.05); DR5的mRNA表達水平與DR4相似，經統(tǒng)計分析，除MGC803外，其它胃癌細胞均低于對照組(P＜0.05)。
　　2、胃癌

10、細胞中DR4和DR5在蛋白水平存在表達水平下調。在MKN28，MGC803，AGS以及SGC7901細胞系中，DR4的蛋白表達水平經統(tǒng)計分析，均明顯低于對照組;DR5的蛋白表達水平與DR4相似，經統(tǒng)計分析，除了MGC803外，其它胃癌細胞均低于對照組(P＜0.05)。
　　3、胃癌細胞中DR4和DR5的啟動子區(qū)存在異常甲基化。在MKN28，MGC803，AGS以及SGC7901細胞系中，DR4均為部分甲基化，而DR5除MGC803

11、為非甲基化外，其余細胞系中均為部分甲基化。
　　4、5-Aza-CdR能夠逆轉胃癌細胞中DR4和DR5的啟動子甲基化水平，并上調DR4和DR5的表達水平。檢測不同濃度5-Aza-CdR處理胃癌細胞系MKN28，AGS及SGC7901不同時間后的細胞增殖狀態(tài)，結果顯示5-Aza-CdR可明顯抑制細胞增殖(P＜0.05)，且明顯表現(xiàn)出藥物濃度及作用時間依賴性;檢測胃癌細胞系在5-Aza-CdR作用后的凋亡狀態(tài)，5-Aza-CdR明顯誘

12、導了細胞凋亡;檢測胃癌細胞系中DR4和DR5的mRNA表達水平，結果顯示5-Aza-CdR能上調胃癌細胞系中DR4和DR5的表達水平，并且具有藥物濃度及作用時間依賴性。
　　5、5-Aza-CdR能夠抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長，并且具有作用時間依賴性。胃癌細胞裸鼠移植瘤生長曲線表明:5-Aza-CdR(1g/Kg)能抑制裸鼠移植瘤的生長，且隨時間增加抑制效果明顯。
　　6、5-Aza-CdR能夠逆轉胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR

13、5的啟動子甲基化水平，并上調DR4和DR5的表達水平。通過檢測5-Aza-CdR（1g/Kg）對胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5表達水平影響，結果顯示5-Aza-CdR能促進DR4和DR5的表達水平;檢測5-氮雜胞苷(1g/Kg)對胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5啟動子甲基化水平影響，結果顯示5-氮雜胞苷(1g/Kg)能顯著抑制DR4和DR5啟動子甲基化水平。
　　結論:
　　1、在胃癌細胞中DR4和DR5無論在mRNA水平還是