食管癌細(xì)胞系中TIMP3、E-cadherin基因甲基化的研究.pdf

1、隨著表觀遺傳學(xué)研究的深入,基因的異常甲基化已經(jīng)受到人們的充分認(rèn)識,腫瘤相關(guān)基因發(fā)生的甲基化,可以導(dǎo)致其表達(dá)失活從而喪失其功能。因此在腫瘤的早期診斷和篩查過程中,基因異常甲基化的改變也許可以為此提供一個重要的分子標(biāo)記。去甲基化藥物的機(jī)制和作用,目前大都處于研究階段,它的出現(xiàn)也為臨床腫瘤病人的治療提供一個新的方法和途徑。食管癌是一種我國常見的消化道惡性腫瘤,嚴(yán)重的威脅了人類的健康。對于食管癌相關(guān)基因甲基化情況的研究,目前相對集中在某些抑癌基

2、因,錯配修復(fù)基因等。而細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 TIMP3和與腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)的E-cadherin基因,在食管癌中的甲基化情況還未完全明了。其表達(dá)狀態(tài)的改變與甲基化修飾是否有關(guān)?改變這些基因的甲基修飾狀態(tài)對食管癌細(xì)胞中該基因表達(dá)是否會有影響及對細(xì)胞的腫瘤特性有何影響均未見相關(guān)報道。
　　 本研究采用甲基化特異性PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法,觀察食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706中TIMP3、E-cadherin基因甲基化的水平及蛋白表達(dá)情

3、況,初步探討其基因表達(dá)失活與甲基化的關(guān)系。并用去甲基化藥5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)和傳統(tǒng)化療藥物5-Fu,分別處理食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706,觀察這兩種藥物作用后TIMP3、E-cadherin基因甲基化狀態(tài)、蛋白表達(dá)的改變及對細(xì)胞周期的影響,了解去甲基化藥物的優(yōu)勢及前景,為藥物應(yīng)用于臨床治療提供依據(jù)
　　 方法：
　　 1體外培養(yǎng)的食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706,于RPMI1640培養(yǎng)基(內(nèi)

4、含10％胎牛血清和100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素)中貼壁培養(yǎng)(37℃,5％CO2)。觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 2提取細(xì)胞EC1和EC9706的DNA,經(jīng)質(zhì)量鑒定后,應(yīng)用甲基化特異性PCRt(MSP)的方法,檢測食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706中TIMP3和E-cadherin基因甲基化的水平。
　　 3制作細(xì)胞爬片,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法,檢測食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706中TIMP3和E-cadherin蛋白

5、表達(dá)的情況。
　　 4體外培養(yǎng)的兩種食管癌細(xì)胞系,分別在含5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)的培養(yǎng)基,及含5-Fu的培養(yǎng)基中,貼壁培養(yǎng)(37℃,5％CO2),并觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　 5提取用藥物干預(yù)后的細(xì)胞EC1和EC9706的DNA,經(jīng)質(zhì)量鑒定后,應(yīng)用甲基化特異性PCR(MSP)的方法,檢測TIMP3和E-cadherin基因甲基化的水平的變化。
　　 6制作經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞的爬片,用免疫細(xì)

6、胞化學(xué)的方法檢測TIMP3和E-cadherin基因蛋白表達(dá)改變的情況。
　　 7同時培養(yǎng)未加藥的EC1和EC9706細(xì)胞,及經(jīng)5-Aza-CdR和5-Fu處理過的細(xì)胞,消化離心后,乙醇固定,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1 TIMP3基因在食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706中都表現(xiàn)為非甲基化,且蛋白呈現(xiàn)弱表達(dá)。E-cadherin基因在食管癌細(xì)胞系EC1中發(fā)生甲基化,在EC9706中發(fā)生

7、半甲基化,其蛋白表達(dá)均缺失。
　　 2 TIMP3基因在經(jīng)5-Aza-CdR和5-Fu作用后的EC1和EC9706細(xì)胞系中,仍為非甲基化；而在EC1中發(fā)生甲基化、EC9706中發(fā)生半甲基化的E-cadherin基因,經(jīng)5-Aza-CdR作用后,甲基化的狀況都得到了逆轉(zhuǎn)；經(jīng)5-Fu作用后的兩種細(xì)胞系中該甲基化的情況沒有改變。
　　 3但經(jīng)藥物5-Aza-CdR和5-Fu分別作用后,TIMP3和E-cadherin基因的蛋白

8、表達(dá)都由原來的弱表達(dá)和不表達(dá),轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)增強(qiáng)和表達(dá)。
　　 45-Aza-CdR和5-Fu均能使處于G1期的細(xì)胞比例增加,S期的細(xì)胞減少。用藥組與未加藥組之間及兩種藥物組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1在食管癌細(xì)胞系EC1和EC9706中呈低表達(dá)的兩種基因E-cadherin、TIMP3其甲基化狀態(tài)不同,前者甲基化程度高,而后者未發(fā)生甲基化。E-cadherin基因的甲基化可能為臨