納米載體介導(dǎo)的Livin RNAi治療大腸癌的實驗研究.pdf

1、大腸癌是臨床上常見的消化道腫瘤之一，且大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升。而腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與凋亡失衡所致，凋亡抑制是腫瘤發(fā)生的重要機制。凋亡的調(diào)節(jié)機制非常復(fù)雜，近年發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(IAP)是一類重要的分子水平的抗凋亡調(diào)節(jié)因子，Livin是新近發(fā)現(xiàn)的一個IAP家族成員，研究表明，Livin在多數(shù)腫瘤中表達(dá)，而在除胎盤外的大多數(shù)終末分化組織中低表達(dá)或不表達(dá)。在大多數(shù)研究livin在腫瘤中的表達(dá)中，認(rèn)為高表達(dá)的Livin mRNA和蛋白是

2、腫瘤進(jìn)展的預(yù)兆標(biāo)記，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。因此許多種以IAP為靶點的抗腫瘤研究多聚焦于Livin，通過調(diào)控Livin基因也許可以為腫瘤的治療提供新靶點。Livin與大腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等關(guān)系及針對Livin治療大腸癌研究目前國內(nèi)外還未見詳細(xì)報道。 RNA干擾技術(shù)(RNAi)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，RNAi引發(fā)的基因沉默作用是特異的和有效的，具有抑制作用強、穩(wěn)定性高、細(xì)胞攝取相對容易等優(yōu)點，為腫瘤的基因治療提供新的

3、、有前途的手段。是當(dāng)前基因治療研究最廣為應(yīng)用的基因沉默工具。小干擾RNA(siRNA)選擇性抑制基因表達(dá)使基因治療達(dá)到最大的特異性，但是弱小的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入能力、有限的血液穩(wěn)定性及非特異的免疫原性阻礙了siRNA基因治療的發(fā)展。目前，國內(nèi)外的研究都沒能有效解決將siRNA導(dǎo)入體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率低下的問題。 基因轉(zhuǎn)運需要合適的載體，理想的基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，應(yīng)具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率、良好的靶向性和生物相容性、較高的穩(wěn)定性及生物可降解性。目前

4、的病毒載體和非病毒脂質(zhì)體載體都存在不同程度的缺陷，因而尋找一種理想的基因載體就成為當(dāng)務(wù)之急。納米基因轉(zhuǎn)運體的研制是目前國際納米生物和腫瘤基因治療研究領(lǐng)域重要的前沿性課題。納米顆粒體積小，可在血管中隨血液循環(huán)、透過血管壁進(jìn)入各個臟器的細(xì)胞中，作為新型非病毒型基因載體能有效介導(dǎo)DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并使其在細(xì)胞內(nèi)高水平的表達(dá)，從而為基因表達(dá)、功能研究及基因治療提供了新的技術(shù)和手段。殼聚糖(CS)是一種天然多聚糖，已有研究表明，殼聚糖納米粒有良好的生

5、物相容性和生物可降解性，且可通過修飾改性增加其靶向性和緩釋性，是一種良好的基因載體。我們擬通過接枝共聚的方法將親水無毒的聚乙二醇(PEG)鏈段引入殼聚糖鏈段中以增加其水溶性和緩釋性，從而增加基因轉(zhuǎn)染效率。 基于以上背景和已有的研究成果，我們先用RT-PCR和Westernblot方法分別從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測Livin基因的表達(dá)情況及與大腸腫瘤特性的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在所有的癌旁和正常組織中，Livin均不表達(dá)，而在腫瘤組織

6、中，陽性表達(dá)率卻達(dá)45.5％，兩種方法的檢測結(jié)果一致，說明Livin是大腸癌的一種標(biāo)志物，這不僅有助于大腸癌的診斷，而且可以為大腸癌的生物治療提供依據(jù)；分析Livin表達(dá)與結(jié)直腸癌患者主要臨床參數(shù)之間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，Livin在結(jié)直腸癌中表達(dá)情況與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、組織學(xué)類型、淋巴是否轉(zhuǎn)移、Dukes分期均無顯著相關(guān)性，而與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及放化療密切相關(guān)(p<0.05)，提示Livin的表達(dá)可以影響結(jié)直腸癌的生物學(xué)行為，使其更

7、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性行為，是預(yù)后不良的指征之一；在放化療后腫瘤組織中Livin表達(dá)也明顯升高，提示其與腫瘤的耐藥性有關(guān)?？赡転榇竽c癌的診斷和預(yù)后判斷提供新的分子生物學(xué)指標(biāo)，同時也為下一步的腫瘤基因治療提供了實驗基礎(chǔ)。 在第二部分，我們設(shè)計、合成了Livin shRNA，與pGenesil-1質(zhì)粒載體鏈接構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過酶切電泳、基因測序證實是否正確構(gòu)建，通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)Livin的大腸癌HT-29細(xì)胞檢測Livin mRNA下降

8、水平，篩選出最佳的shRNA。結(jié)果重組質(zhì)粒pGenesil-shRNA經(jīng)酶切電泳、基因測序證明寡核苷酸片段成功插入預(yù)計位點，且序列與我們設(shè)計合成的完全一致，說明我們成功地構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體pGenesil-shRNA重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞livin mRNA含量較轉(zhuǎn)染前及對照組均有明顯的下降(p<0.01)，說明我們制備的shRNA能有效抑制Livin基因的表達(dá)，其中尤以Livin1抑制作用明顯，抑

9、制率達(dá)到66％。故在后續(xù)研究中，我們均以Livin1作為實驗?zāi)０?，探討針對Livin基因的RNAi對腫瘤的治療作用。 第三部分先通過接枝共聚的方法制備殼聚糖-聚乙二醇(CS-PEG)納米粒，用透射電鏡、激光粒度分析儀考察其形態(tài)、粒徑、ζ電位，MTT法考察其細(xì)胞毒性，不同的基因/納米粒材料比制備基因納米復(fù)合物，通過其形態(tài)、粒徑、ζ電位、載藥量、包封率、基因保護(hù)實驗考察藥物的理化特性，轉(zhuǎn)染后EGFP蛋白表達(dá)和LivinmRNA抑制率

10、比較考察基因轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果制備的空白納米粒粒徑約60nm，細(xì)胞毒性較脂質(zhì)體要低；在基因：納米粒為1:5時(質(zhì)量比)制備的基因納米復(fù)合物粒徑約為120nm，ζ電位為6.6mV，包封率和載藥量分別為79.4％和32.3％，對基因有較好的保護(hù)作用，選此條件下制備的基因納米復(fù)合物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，持續(xù)作用時間較脂質(zhì)體和裸基因均要長，轉(zhuǎn)染72h后的Livin mRNA抑制率較兩對照組明顯增強(分別為p<0.05和p<0.01)。故后續(xù)研究中以此基因納

11、米復(fù)合物進(jìn)行基因治療研究。 第四部分為納米載體介導(dǎo)的RNAi治療結(jié)腸癌研究。培養(yǎng)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞后，以基因納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染，72h后用RT-PCR和westernblot檢測Livin mRNA和蛋白質(zhì)抑制率，用流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡情況，從體外考察基因治療效果；建立裸鼠結(jié)腸癌動物模型，以基因納米復(fù)合物作瘤內(nèi)多次注射，繪制腫瘤生長曲線，24d后切取腫瘤檢測體積抑制率和瘤重抑制率，組織切片TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)

12、(AI)，從動物在體模型考察基因治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組Livin mRNA和蛋白質(zhì)的抑制率為78％和76％，較假性治療組顯著增強(p<0.01)；試驗組的腫瘤生長明顯減慢，瘤重抑制率和體積抑制率分別為74％和80％，較假性治療組明顯增強(p<0.01)；切片組織的凋亡細(xì)胞較對照組明顯增多，AI增高(p<0.01)。說明我們制備的CS-PEG納米載體介導(dǎo)的Livin shRNA對Livin高表達(dá)的結(jié)腸癌有很好的治療效果。 本研究