Flt-1靶向隱形納米粒治療結(jié)腸癌及其肺轉(zhuǎn)移性腫瘤的研究.pdf

1、惡性腫瘤細(xì)胞離開原發(fā)部位，經(jīng)體腔、血管和/或淋巴管等途徑到達(dá)身體其它部位繼續(xù)生長，稱為腫瘤轉(zhuǎn)移。研究表明，大部分結(jié)腸癌患者會發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致患者死亡的首要原因。血管生成在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，目前抗血管生成療法在結(jié)腸癌的治療中逐漸發(fā)展起來，但是其脫靶效應(yīng)導(dǎo)致了較多的毒性和副作用。
　　為在腫瘤治療中減少脫靶效應(yīng)引起的不良反應(yīng)，實現(xiàn)藥物的靶向遞送，納米給藥系統(tǒng)介導(dǎo)的靶向治療現(xiàn)已發(fā)展成為具有良好應(yīng)用前景的治療策略。目前

2、臨床上納米給藥系統(tǒng)用于腫瘤治療的主要作用機(jī)制在于其通過EPR（enhanced permeation and retention）效應(yīng)在體積較大、血管化良好的腫瘤組織內(nèi)蓄積。然而，研究發(fā)現(xiàn)，體積?。?100 mm3）、血管化較差的腫瘤組織（如轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌等）通過 EPR效應(yīng)獲得的腫瘤靶向作用顯著受限。值得注意的是，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）直接暴露在血液循環(huán)中，它們比腫瘤細(xì)胞特別是高間質(zhì)壓力包圍下的深部腫瘤實質(zhì)細(xì)胞更容易暴露在藥物的作用之

3、下。因此納米給藥系統(tǒng)介導(dǎo)的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向抗血管生成治療可能是治療結(jié)腸癌及其轉(zhuǎn)移性腫瘤的有效策略。
　　本研究以PEG-PLA高分子聚合物為載體材料制備納米粒，裝載具有高活性抗血管生成作用的化療藥物長春新堿（vincristine，VCR），并將F56多肽修飾在納米粒的表面，構(gòu)建了一種新型腫瘤血管靶向給藥系統(tǒng)— Flt-1靶向長春新堿隱形納米粒（F56-VCR-NP）。通過F56多肽與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)的 Flt-1（

4、VEGFR-1）受體之間特異性的相互作用，實現(xiàn)納米粒對結(jié)腸癌腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的主動靶向，借助長春新堿的高活性抗血管生成作用，實現(xiàn)對結(jié)腸癌及其肺轉(zhuǎn)移性腫瘤的靶向抗血管生成治療。
　　采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備裝載VCR的隱形納米粒（VCR-NP），通過聚合物材料末端醛基（-CHO）與F56多肽末端氨基（-NH2）之間的共價結(jié)合將F56多肽連接到VCR-NP表面，制得裝載VCR的主動靶向隱形納米粒（F56-VCR-NP）。F56-VCR

5、-NP的載藥量為1.9％，包封率為21.4%。透射電鏡（TEM）下觀察到納米粒大小均勻，外觀圓整，無粘附、聚集現(xiàn)象。Malvern Zetasizer Nano ZS納米粒度及Zeta電位分析儀測得F56-VCR-NP粒徑為153 nm，Zeta電位為-20.8 mv。X-射線光電子能譜（XPS）和CBQCA試劑盒分析證明納米粒表面多價連接F56多肽。體外釋放實驗表明制備的隱形納米粒具有良好的緩釋特性。SD大鼠藥動學(xué)實驗結(jié)果表明，隱形納

6、米粒體內(nèi)具有良好的長循環(huán)特性。
　　采用香豆素6（coumarin6）作為熒光探針標(biāo)記納米粒，激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）下觀察納米粒對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的靶向性。結(jié)果表明，F(xiàn)56多肽可通過與HUVEC表面高表達(dá)的 Flt-1受體特異性結(jié)合介導(dǎo)納米粒內(nèi)吞進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，該內(nèi)化過程需要消耗能量（ATP），并且細(xì)胞膜小窩（caveolae）可能參與了這一過程。通過CCK-8細(xì)胞增殖實驗、Transwell細(xì)胞遷移實驗

7、和Matrigel毛細(xì)小管形成實驗研究F56-VCR-NP對HUVEC增殖、遷移和小管形成的影響。實驗結(jié)果表明，與VCR和VCR-NP相比，F(xiàn)56-VCR-NP對HUVEC增殖（VCR濃度范圍為1-100 nM）、遷移（VCR濃度范圍為10-4-100 nM）和毛細(xì)小管形成（VCR濃度范圍為0.01-100 nM）的抑制作用顯著增強(qiáng)。
　　以DiR作為熒光探針標(biāo)記納米粒，荷HCT-15結(jié)腸癌的BALB/c裸鼠為動物模型，采用小動物

8、活體成像技術(shù)（Xenogen）考察隱形納米粒對腫瘤組織的靶向性。給藥96 h后解剖裸鼠，小動物活體成像儀下觀察各組織內(nèi)的熒光強(qiáng)度。實驗結(jié)果顯示，尾靜脈給藥后3 h，游離DiR和未經(jīng)多肽修飾的DiR標(biāo)記的NP（DiR labeled NP）在腫瘤組織中只有較少蓄積，而DiR標(biāo)記的F56-NP（DiR labeled F56-NP）已在腫瘤組織中有大量蓄積。直到給藥后96 h時，DiR labeled F56-NP組中裸鼠腫瘤部位仍有大量的

9、納米粒滯留。并且，該效應(yīng)可被游離F56多肽阻斷。這一結(jié)果提示，F(xiàn)56多肽修飾可顯著增強(qiáng)納米粒對HC T-15腫瘤組織的靶向性。
　　以香豆素6為熒光探針標(biāo)記 F56-VCR-NP（coumarin6 labeled F56-VCR-NP），荷HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞的BALB/c裸鼠為動物模型，評價納米粒對結(jié)腸癌腫瘤血管的靶向性及其抗血管生成作用。尾靜脈給藥后2 h和48 h，取腫瘤組織，切片，進(jìn)行免疫組化和免疫熒光染色。結(jié)果顯示，

10、和VCR-NP相比，給藥后2 h和48 h時F56-VCR-NP在HCT-15腫瘤組織的積聚顯著增加，在48 h時F56-VCR-NP可誘導(dǎo)更多的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起腫瘤組織大面積壞死，且這一作用可被游離F56多肽所阻斷。實驗結(jié)果提示，F(xiàn)56多肽修飾能夠?qū)崿F(xiàn)納米粒對HCT-15腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向性，引起腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤組織的壞死。
　　Balb/c小鼠尾靜脈注射CT-26.WT細(xì)胞建立結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移模型

11、，探討 F56-VCR-NP對結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移性腫瘤血管的靶向性和抗血管生成作用，評價其抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果表明，和VCR-NP相比，F(xiàn)56-VCR-NP可快速（給藥后2 h）準(zhǔn)確靶向結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并且這一作用可被游離 F56多肽阻斷。與Control、NP、F56-NP、VCR和VCR-NP等處理組小鼠相比，F(xiàn)56-VCR-NP治療組小鼠的生存期顯著延長（中位生存期為55天）。治療過程中，VCR和

12、VCR-NP處理組小鼠體重出現(xiàn)不同程度減輕和飲食飲水量的減少，F(xiàn)56-VCR-NP組未出現(xiàn)顯著體重減輕、飲食飲水下降等毒性。肺轉(zhuǎn)移腫瘤組織的H&E染色結(jié)果顯示，與Control、VCR和VCR-NP等處理組相比，F(xiàn)56-VCR-NP使小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶面積顯著減小。免疫組化結(jié)果顯示，與Control等對照組相比，F(xiàn)56-VCR-NP處理組腫瘤組織微血管密度顯著減少，腫瘤細(xì)胞增殖顯著減少，腫瘤細(xì)胞凋亡顯著增加。
　　本研究首次構(gòu)建了腫瘤