基于負載USPIO脂質(zhì)納米粒肝組織雙靶向分子影像實驗研究.pdf

1、固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLN)是近年來正在發(fā)展的一種新型納米粒給藥系統(tǒng)，以固態(tài)的天然或合成的類脂如單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、三酰甘油等為載體，將藥物或造影劑包裹于類脂核中制成酸態(tài)給藥體。因其表面的強疏水性，靜脈注射進入機體后，很快被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(Reticuloendothelial system，RES)吞噬而被動進入肝脾，具有顯著的被動肝靶向作用。去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglyco

2、protein receptor, ASGPR)是一種完全由哺乳動物肝竇狀隙的肝實質(zhì)細胞特異性表達的膜表面蛋白，能夠特異性地識別帶有半乳糖殘基的糖蛋白，每個肝細胞表面有多達5105個受體，而在肝炎、肝硬化、肝癌或肝轉(zhuǎn)移癌等肝臟疾病時，其數(shù)量和功能均有所下降。半乳糖是肝細胞表面ASGPR的特異性配體，是肝靶向基團，具有誘導和提高肝細胞在細胞外基質(zhì)支架材料上的粘附性能。本研究選擇以SLN作為載體，利用SLN自身的肝臟被動靶向特征，結(jié)合肝臟的

3、主動靶向修飾技術，制備了經(jīng)半乳糖修飾的以SLN為包被材料的對肝具有雙靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒Gal-SLN-USPIO，并在體外和體內(nèi)實驗中考察了其對正常肝細胞、肝癌細胞及正常肝組織的靶向作用，以及對原位移植肝癌模型的診斷價值。具體研究內(nèi)容主要包括以下四個部分:
　　第一部分:脂質(zhì)磁性納米粒的制備及理化性質(zhì)研究
　　本研究首先采用乳糖酸(LA)和硬脂胺(ODA)之間的化學耦合反應制備半乳糖-硬脂胺嫁接物(Gal-ODA)，采

4、用核磁共振氫譜(1H NMR)和傅里葉變換紅外光譜(FTIR)對其化學結(jié)構(gòu)進行確證;在此基礎上，以單甘脂為脂質(zhì)材料，采用水性溶劑擴散法分別制備對肝臟具有被動靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒(SLN-USPIO)、主動靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒(Gal-SLN-USPIO/PEG)及雙重靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒(Gal-SLN-USPIO)，其中SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG作為對照組，并對三種脂質(zhì)磁性納米粒的理化性質(zhì)進行了

5、評價。采用微粒粒度及表面電位分析儀測定三種不同的脂質(zhì)磁性納米粒的粒徑、表面電位及其分布，采用透射電鏡(TEM)觀察脂質(zhì)磁性納米粒的形態(tài)。研究結(jié)果表明，本研究所制備得到的三種脂質(zhì)磁性納米粒數(shù)均粒徑在45～60 nm之間，表面電位在-27～-35 mV之間，多分散指數(shù)在0.14～0.35之間，三者之間無顯著性差異;脂質(zhì)磁性納米粒均呈擬球形，大小均勻，表面平滑完整，顆粒分散性良好，常溫放置2周后未見明顯聚集現(xiàn)象;外加強磁場吸附實驗考察證實脂質(zhì)

6、納米粒中均包裹有磁性Fe3O4納米顆粒。
　　第二部分:脂質(zhì)磁性納米粒的體外細胞實驗及在體正常肝組織靶向性研究
　　本研究采用異硫氰酸熒光素(FITC)標記脂質(zhì)磁性納米粒;以小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7為被動靶向細胞模型，人正常肝細胞LO2為主動靶向細胞模型和人肝癌細胞HepG2為疾病細胞模型，采用激光共聚焦顯微鏡定性和流式細胞計數(shù)儀定量研究三種細胞對不同脂質(zhì)磁性納米粒的攝取情況;采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（M

7、TT實驗）考察不同的脂質(zhì)磁性納米粒分別對三種細胞的毒性;采用脂溶性DiR作為近紅外熒光染料，制備DiR標記磁性脂質(zhì)納米粒，采用小動物活體熒光成像儀觀察不同的脂質(zhì)磁性納米粒在正常裸鼠肝臟的分布。研究結(jié)果表明:RAW264.7細胞對SLN-USPIO的攝取強于Gal-SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG，LO2細胞對Gal-SLN-USPIO的攝取強于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG，而HepG2細胞

8、對三種脂質(zhì)磁性納米粒的攝取無明顯差異性;LO2和HepG2兩種細胞共孵育競爭性攝取實驗表明，LO2細胞對Gal-SLN-USPIO的攝取明顯強于HepG2細胞對Gal-SLN-USPIO的攝取，這一研究結(jié)果為后續(xù)的在體肝癌模型分子成像及診斷提供了可能;三種脂質(zhì)磁性納米粒在濃度達到100μg/ml時，各種細胞的存活率均在80％以上，說明本研究所制備的脂質(zhì)磁性納米粒具有較低的毒性，對臨床應用具有可靠的安全性;在體肝臟分布研究結(jié)果表明，對肝臟

9、具有雙靶向功能的Gal-SLN-USPIO在不同時間點的肝臟分布均強于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG對照組，該結(jié)果提示具有雙靶向功能的Gal-SLN-USPIO有望成為肝臟疾病診斷的磁共振造影劑。
　　第三部分:脂質(zhì)磁性納米粒的體外細胞MR成像研究
　　配制7管鐵濃度分別為0、1、10、15、25、50，100μg/ml的Gal-SLN-USPIO納米粒懸液，經(jīng)3.0T磁共振掃描儀獲得T2*WI圖像，

10、測定各管T2*弛豫時間，評價所制備的脂質(zhì)磁性納米粒Gal-SLN-USPIO的負性強化效果;分別對攝取三種不同脂質(zhì)磁性納米粒后的人正常肝細胞LO2和人肝癌細胞HepG2進行MR成像，以其信號強度的差異性分析不同脂質(zhì)磁性納米粒對LO2和HepG2兩種細胞的靶向攝取能力。研究結(jié)果表明，所制備的Gal-SLN-USPIO的T2*信號強度隨濃度的增加而減低;T2*時間測量結(jié)果顯示，隨著脂質(zhì)磁性納米粒濃度的增高，T2*時間逐漸縮短，說明本研究所制

11、備的Gal-SLN-USPIO具有負性造影效果，并存在一定的濃度效應關系，即在一定濃度范圍內(nèi)，Gal-SLN-USPIO濃度越高，其T2*WI負性強化效果越明顯;體外細胞MR成像研究結(jié)果表明，Gal-SLN-USPIO被LO2細胞攝取后，其信號強度降低最明顯，所對應的R2*值明顯大于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG組(p＜0.05);三種脂質(zhì)磁性納米粒被HepG2細胞攝取后，其對應的信號強度及R2*值三者之間無明顯

12、差異(p＞0.05)，這一研究結(jié)果也與之前的體外細胞攝取研究結(jié)果相吻合。以上結(jié)果提示以Gal-SLN-USPIO作為對比劑所構(gòu)建的MR探針具有應用于體內(nèi)成像的可行性，為進一步地體內(nèi)原位肝癌成像實驗奠定了一定的基礎。
　　第四部分:脂質(zhì)磁性納米粒的體內(nèi)MR分子成像研究
　　本研究采用肝癌組織塊原位移植法構(gòu)建HepG2裸鼠原位移植肝癌模型;將腫瘤模型隨機分為三組，每組裸鼠通過尾靜脈分別注射三種脂質(zhì)磁性納米粒（劑量約含鐵0.5μg

13、/g體重）后，采用小動物線圈經(jīng)3.0T磁共振(MR)掃描獲得不同時間點的橫斷位T2WI圖像，測量增強前及增強后不同時間點每組的正常肝組織、腫瘤及背景噪聲的MR信號強度(SI)，計算肝臟組織與腫瘤的信噪比(SNR)、腫瘤-肝臟的對比信噪比(CNR)、每組增強前后之間及增強后三組間CNR的差異;磁共振掃描結(jié)束后處死裸鼠，切取含瘤肝臟組織做常規(guī)HE染色，以證實腫瘤模型構(gòu)建的成功與否;做普魯士藍染色，進一步證實不同脂質(zhì)磁性納米粒在肝臟中的靶向性

14、分布情況。體內(nèi)MR成像的研究結(jié)果表明，三組裸鼠增強后不同時間點T2WI序列肝內(nèi)腫瘤的SNR較增強前均無顯著性差異(p＞0.05)，正常肝組織的SNR較增強前均有顯著性差異(p＜0.05)，增強后Gal-SLN-USPIO組腫瘤-肝臟的CNR較SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG組明顯提高且有顯著性差異(p＜0.05);病理切片HE染色結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的HepG2裸鼠原位移植肝癌模型全部接種成功;普魯士藍染色結(jié)果表

15、明，Gal-SLN-USPIO組正常肝臟組織中的藍色鐵顆粒明顯多于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG組，進一步證實了Gal-SLN-USPIO對肝臟的靶向性明顯強于SLN-USPIO和Gal-SLN-USPIO/PEG。以上研究結(jié)果提示Gal-SLN-USPIO有望成為肝臟靶向的特異性MR探針。
　　總結(jié)以上實驗，本研究成功制備了對肝臟具有主被動雙靶向功能的脂質(zhì)磁性納米粒Gal-SLN-USPIO，并通過體內(nèi)外