細胞核靶向富勒醇固體脂質(zhì)納米粒的輻射防護作用.pdf

1、研究背景:電離輻射作用于機體，產(chǎn)生大量的自由基如(H·)、H2、H2O2、Haq-、O(H·)、eaq-等，這些自由基對機體造成嚴(yán)重的損傷。Templeteton等的研究證實低LET射線造成的電離損傷中，90％是由OH·引起的。OH·使DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致染色體畸變以及遺傳物質(zhì)丟失，所以DNA雙鏈斷裂(DSB)是DNA分子結(jié)構(gòu)中最關(guān)鍵的損傷，也是細胞死亡的主要原因。因此理想的輻射防護藥物應(yīng)該能夠進入細胞內(nèi)，特別是細胞核內(nèi)，在電離輻射產(chǎn)生

2、自由基的瞬間立即清除DNA周圍的自由基。盡管人體中有一些天然存在的自由基清除劑（如超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等），但是這類自由基清除劑無法清除Haq-、OH·等自由基，并且不能穿透生物膜，進入到細胞核內(nèi)。
　　 富勒烯的毒理學(xué)研究證明它是低毒化合物，其水溶性衍生物富勒醇具有良好的自由基清除作用，尤其是與OH·、eaq-的反應(yīng)速率常數(shù)可達(0.5～3.3)×1010M-1S-1。水溶性富勒醇能夠快速穿

3、過細胞膜，到達細胞內(nèi)，并且主要分布在胞漿以及線粒體等細胞器中。目前，國內(nèi)外相關(guān)研究主要是將富勒烯聯(lián)接上不同的化學(xué)基團，形成新的富勒烯衍生物，從而得到廣泛應(yīng)用。但是，迄今為止，仍然沒有富勒烯及其衍生物能夠被載帶并進入到細胞核內(nèi)，作為輻射防護劑或者自由基清除劑的報道。
　　 目的:建立一種新型的細胞核靶向納米載藥系統(tǒng)，能夠高效載帶富勒醇到達細胞質(zhì)以及細胞核內(nèi)，清除電離輻射產(chǎn)生的自由基，從而為研發(fā)輻射防護藥物提供實驗數(shù)據(jù)。
　　

4、 方法:以四丁基氫氧化銨(TBAH)催化法合成富勒醇，通過傅立葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜以及質(zhì)譜檢測對其進行鑒定和表征。采用高壓乳勻法制備新型細胞核靶向富勒醇固體脂質(zhì)納米粒C60(OH)24-NLC-E，其表面連接與核受體有高度親和力的己烯雌酚，通過納米粒度儀檢測其大小及分布，掃描電鏡觀察其微觀形態(tài)。使用激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察包裹羅丹明-6G的C60(OH)24-NLC-E進入細胞的過程。通過MTT比色法測定C60(OH)24-N

5、LC-E對V79細胞的毒性作用;通過細胞克隆形成實驗觀察該納米粒對V79細胞的輻射防護作用;通過對V79細胞進行γ-H2AX焦點分析，觀察其對DNA分子的輻射防護作用。
　　 結(jié)果:(1)、以胺催化合成法制備富勒醇，對新合成的富勒醇進行紅外光譜分析，在3433cm-1處可見強而寬的羥基吸收峰，又進行氫核磁共振譜分析，可見δ=3.34處為氘代DMSO中含有雜質(zhì)水所產(chǎn)生的水峰，δ=2.50處為DMSO溶劑吸收峰，δ=1.24處為羥基

6、特征峰，進一步進行質(zhì)譜分析，m/z=720的主峰表示C60分子量，此外，在720-1128范圍內(nèi)的峰，平均間隔為68，恰好為4個羥基的分子量，在m/z=1128處的峰為C60(OH)x的準(zhǔn)分子離子峰，與C60(OH)24的分子量相符。(2)、對于新制備的納米脂質(zhì)載體C60(OH)24-NLC-E，經(jīng)過檢測可見其形態(tài)近似球形，大小較為均一，直徑大約300nm左右。通過激光共聚焦顯微鏡觀察包裹羅丹明-6G的C60(OH)24-NLC-E，能

7、夠快速進入細胞，甚至細胞核內(nèi)，15～30min達到飽和。(3)、當(dāng)C60(OH)24-NLC-E濃度＜1.5μmol/L時，細胞存活率超過95％。(4)、經(jīng)過60Co-γ射線照射0～8Gy時，于照射前30min加入C60(OH)24-NLC-E(1.27μmol/L)的加藥組細胞生存率明顯大于單純照射組(p＜0.05)，并且加藥組的Do和Dq值也明顯高于單純照射組(p＜0.05)。(5)、于照射前30min加入C60(OH)24-NLC