載普魯士藍靶向納米復合物多模態(tài)顯像及綜合治療裸鼠乳腺癌的實驗研究.pdf

1、第一部分、載普魯士藍靶向納米復合物的制備及性能檢測
　　目的：
　　1.制備一種載普魯士藍靶向納米復合物（PLGA-PB-PTX-PEG-FA），并檢測其基本性質(zhì)。
　　2.研究載普魯士藍靶向納米復合物體外尋靶能力和聯(lián)合激光對細胞活性的影響。
　　方法：
　　1.以PEG化連接了葉酸（folic acid，F(xiàn)A）的PLGA作為成膜材料，采用雙乳化法，制備裝載普魯士藍納米粒子（Prussian blue na

2、noparticles，PB NPs）和紫杉醇（Paclitaxel，PTX）的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向納米復合物，并對其粒徑、電位、表面形態(tài)等進行檢測；用紫外-可見分光光度法、傅里葉紅外光譜儀、激光共聚焦顯微鏡檢測其紫外吸收光譜、紅外光譜和各組分結(jié)構(gòu)特征；采用0.647W/cm2,808nm的激光輻照檢測其體外光熱特性；納米復合物中紫杉醇的包封率及載藥量用高效液相色譜法檢測。
　　2.體外培養(yǎng)乳腺癌細胞株MDA-

3、MB-231，激光共聚焦評價PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向納米復合物體外細胞尋靶能力。采用CCK8法檢測所制備的靶向納米復合物聯(lián)合激光輻照對細胞的毒性。
　　結(jié)果：
　　1.透射電鏡和掃描電鏡觀察制得的PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物呈球形，形態(tài)規(guī)則，大小尚均勻，分散度好。Malvern激光粒徑儀檢測出PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物粒徑為（236.6±55.04）nm，表面電位為（-2

4、4.44±1.7）mV。紫外-可見分光光度計檢測出在PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物和PB NPs吸收波峰位于702nm附近。傅里葉紅外光譜圖結(jié)果顯示，PLGA-PTX-PEG-FA和PB NPs的吸收峰位于1756.23cm-1 and2086cm-1，而PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物同時具有上述兩個特征峰。激光共聚焦顯微鏡顯示，PB NPs激發(fā)后為綠色熒光，PLGA-PTX-PEG-FA為紅色熒光，而P

5、LGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物為橙黃色熒光。激光輻照下，PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物具有良好的光熱特性和光熱穩(wěn)定性，且隨著PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物濃度增加或激光能量的增加，納米復合物的光熱轉(zhuǎn)化效能增高。由高效液相色譜法檢測PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物中紫杉醇包封率為77.82%，載藥量為7.22%，具有良好的緩釋特性，在激光輻照下可加快藥物的釋放。
　　2.體

6、外細胞尋靶實驗顯示，紅色熒光靶向納米復合物附著于MBA-MD-231乳腺癌細胞表面，而非靶向組，受體封閉組這兩個組的細胞周圍幾乎沒有紅色的熒光納米復合物。CCK8法結(jié)果顯示，PLGA-PB-PTX-PEG-FA聯(lián)合激光輻照組MBA-MD-231的細胞活性最低，證實其具有體外綜合化療和光熱治療的作用。
　　結(jié)論：成功制備出球形、形態(tài)規(guī)則，大小均勻，性質(zhì)穩(wěn)定的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向納米復合物。該納米復合物具有良好的光

7、學吸收性能和光熱轉(zhuǎn)化特性，載藥量較高，在體外對MBA-MD-231乳腺癌細胞有良好的靶向能力，聯(lián)合激光輻照，在體外具有良好的聯(lián)合化療和光熱治療腫瘤細胞的能力。
　　第二部分、載普魯士藍靶向納米復合物體內(nèi)尋靶，光聲/磁共振多模態(tài)顯像實驗研究
　　目的：觀察PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物體外增強磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、光聲成像（Photoacoustic ima

8、ging，PAI）成像的能力；于體內(nèi)實驗觀察PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物對裸鼠MDA-MB-231移植瘤的靶向效果，及PA/MRI多模態(tài)成像效果，了解PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物增強PA/MRI的能力及原理。
　　方法：
　　1.選取10只MDA-MB-231移植瘤裸鼠進行小動物活體熒光成像，隨機分為兩組：靶向納米復合物（DIR/PLGA-PB-PTX-PEG-FA）組和非靶向納米復合物（

9、DiR/PLGA-PB-PTX-PEG）組，每只裸鼠經(jīng)尾靜脈緩慢注射0.2mL（20mg/mL）納米復合物。注射成功后分別于1h、2h、4h、6h及24h利用小動物活體熒光成像系統(tǒng)采集圖像。對比觀察兩組腫瘤局部的熒光強度，圖像的定量分析利用Living Image軟件系統(tǒng)測得。待24h成像完畢后，處死裸鼠，解剖腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦，行離體熒光成像，并計算各部位離體熒光強度。
　　2.配置不同濃度的PLGA-PB-PTX-P

10、EG-FA納米復合物和PLGA-PTX-PEG-FA，對照組為雙蒸水，使用Vevo?LAZR光聲成像系統(tǒng)和3.0T磁共振掃描儀分別采集光聲圖像和T1*WI圖像。應用光聲系統(tǒng)自帶軟件測量各樣品的光聲值。應用系統(tǒng)軟件測定各樣本信號強度，計算各樣品的信號增強百分比。建立裸鼠MDA-MB-231移植瘤模型，選擇15只隨機分為三組，經(jīng)尾靜脈分別緩慢注射靶向納米復合物（PLGA-PB-PTX-PEG-FA）、非靶向納米復合物（PLGA-PB-PTX

11、-PEG）及生理鹽水。注射前及注射后1h、2h、4h、6h及24h利用光聲成像儀采集圖像。利用儀器自帶軟件對注射試劑前后的腫瘤感興趣區(qū)的圖像進行光聲信號定量分析，計算各樣品的光聲信號比率。同樣的分組方法，利用Philips3.0T超導型磁共振儀和小動物線圈采集腫瘤在不同時間的T1WI圖像，測量各時間點增強前后同一層面裸鼠腫瘤及大腿肌肉感興趣區(qū)的信號強度值（Signal intensity,SI）SItumor及SImuscle，計算相對

12、信號強度（Relative signal intensity，SIr）及信號強度增強率（Percentage of signal intensity enhancement,PSIE）
　　結(jié)果：
　　1.結(jié)果顯示注射前兩組均未見熒光顯示，在尾靜脈注射靶向納米復合物后，靶向組腫瘤內(nèi)部、脾、腦、脊柱可見DiR標記的靶向納米復合物聚集發(fā)出的紅色熒光，在注射后1h熒光最強。隨時間延長，腫瘤、脊柱、腦部的熒光強度逐漸減低，而肝區(qū)的熒

13、光強度逐漸加強。在注射后24h，腫瘤區(qū)域、脾和肝區(qū)仍可見少量熒光顯示。而尾靜脈注射非靶向納米復合物后，非靶向組腫瘤內(nèi)部沒有熒光顯示，而肝區(qū)見熒光顯示，24h后消失。離體活體熒光可見兩組的肝、脾、肺均有熒光顯示，但只有靶向組的腫瘤有熒光顯示，非靶向組的腫瘤沒有熒光聚集。Living Image軟件系統(tǒng)分析靶向組在體和離體腫瘤及離體脾組織區(qū)域熒光強度均明顯高于非靶向組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2.體外光聲顯影結(jié)果和體外

14、MRI結(jié)果顯示，與不含PB NPs的納米粒（PLGA-PTX-PEG-FA）及雙蒸水相比，PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物可明顯增強光聲顯像和MRI T1顯像，且隨著PLGA-PB-PTX-PEG-FA納米復合物濃度的增加，光聲顯像和MRI顯像增強，光聲值和MRI信號增強百分比（PSIE）也逐漸增強，與PLGA-PTX-PEG-FA組和雙蒸水組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。體內(nèi)部分，靶向組在注射靶向納米復合物后，腫

15、瘤區(qū)域光聲信號和MRI信號在1h最明顯，然后逐漸下降，但在注射后24h依然還有明顯光聲信號和MRI信號。而非靶向組和生理鹽水組未見明顯光聲和MRI增強顯影。靶向組光聲信號比率和信號強度增強率與其他兩組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：制備的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向納米復合物，具有良好的體內(nèi)靶向能力，可以特異性靶向至腫瘤區(qū)域。其具有體外光聲和磁共振顯影的性能，并且可增強乳腺癌移植瘤的光聲及磁共振顯像，

16、是一種有效的多模態(tài)成像靶向納米復合物。
　　第三部分、載普魯士藍靶向納米復合物綜合治療裸鼠乳腺癌的研究
　　目的：研究PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向納米復合物聯(lián)合激光促進藥物釋放對裸鼠MDA-MB-231移植瘤的綜合治療效果。
　　方法：選取35只MDA-MB-231移植瘤裸鼠，隨機分為7組：PBS對照組（control）、單純紫杉醇藥物組（PTX）、不含藥物納米粒組（PLGA-PB-PEG-FA）、靶向納米

17、復合物組（PLGA-PB-PTX-PEG-FA）、不含藥物納米粒+激光輻照組（PLGA-PB-PEG-FA+NIR）、靶向納米復合物+激光輻照組（PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR）和單純激光輻照組（NIR）。各組給予尾靜脈注射相對應試劑，其中PLGA-PB-PEG-FA+NIR和PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR組在注射試劑后1h左右，用808nm輸出功率0.647W/cm2的激光輻照腫瘤區(qū)域10min。激光輻照組

18、則僅用上述參數(shù)激光輻照腫瘤區(qū)域10min。用紅外成像儀檢測上述處理導致的溫度變化，每10s記錄一次溫度。定期測量腫瘤體積大小，計算相對腫瘤體積（The relative tumor volumes，RTV）。于治療后21d處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織并稱取質(zhì)量，計算腫瘤抑瘤率（Tumor inhibition rate，TIR）。腫瘤細胞的增殖和凋亡分別用免疫組化PCNA法和TUNEL法檢測，計算腫瘤細胞增殖指數(shù)(Proliferation

19、index,PI)和凋亡指數(shù)（Apoptotic index，AI）。HE染色查看各組裸鼠腫瘤壞死情況及PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR組和對照組裸鼠的心、肝、脾、肺、腎病理切片情況。
　　結(jié)果：尾靜脈注射PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶向納米復合物后1h，激光輻照腫瘤區(qū)域后，腫瘤表面的溫度迅速上升，上升至52±3.05℃。PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR組荷瘤裸鼠的腫瘤在處理后3天結(jié)痂，處理后12天

20、明顯縮小，到處理后第21天，未見明顯增長，腫瘤體積與其他各組相比縮小最明顯，相對腫瘤生長曲線呈逐漸下降的趨勢。其他各組腫瘤均有不同程度的增長。除了NIR組，PLGA-PB-PEG-FA組和對照組，其他各處理組相對腫瘤體積兩兩比較P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR組表現(xiàn)出明顯的抑瘤效果，質(zhì)量抑瘤率為98.86%，其他各組抑瘤率依次下降。PCNA和TUNEL結(jié)果顯示PLGA-PB-PTX-PEG-

21、FA+NIR組PI指數(shù)最低，AI指數(shù)最高。除了NIR組，PLGA-PB-PEG-FA組和對照組，其他各處理組PI指數(shù)及AI指數(shù)分別兩兩比較P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。腫瘤組織HE染色，PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR組可見大量壞死，鏡下呈紅色片狀無結(jié)構(gòu)區(qū)域。PLGA-PB-PTX-PEG-FA+NIR組的心、肝、脾、肺、腎和對照組對比，HE染色未見明顯異常。
　　結(jié)論：制備的PLGA-PB-PTX-PEG-FA靶