99Tcm標(biāo)記ZHER2-V2分子探針乳腺癌荷瘤裸鼠顯像研究.pdf

1、目的：本研究通過放射性核素99Tcm標(biāo)記ZHER2：V2親和體制備分子影像探針，應(yīng)用單光子計算機(jī)斷層成像儀（single photon emission computed tomography，SPECT）對乳腺癌HER2不同表達(dá)水平的荷瘤裸鼠模型進(jìn)行顯像對比研究，探索99Tcm標(biāo)記ZHER2：V2分子探針檢測HER2高表達(dá)乳腺癌的可行性。測定99Tcm-ZHER2：V2分子探針室溫靜置20min的放化純，評價其體內(nèi)外穩(wěn)定性；觀察該探針

2、在HER2高表達(dá)人乳腺癌BT474細(xì)胞（1~2×106 HER2 receptors/cell）與HER2低表達(dá)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞（4×104 HER2 receptors/cell）的攝取、滯留、內(nèi)化、阻斷情況，以了解該分子探針在體外的藥代動力學(xué)及特異性；應(yīng)用99Tcm-ZHER2：V2分子探針對人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型進(jìn)行體內(nèi)分布研究，分析該探針在荷瘤裸鼠體內(nèi)各器官的分布及其對腫瘤組織的靶向性；應(yīng)用SP

3、ECT對以上兩種腫瘤細(xì)胞構(gòu)建的荷瘤裸鼠模型進(jìn)行顯像對比研究；通過免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry IHC）技術(shù)分析實驗所用的BT474及MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞及BT4747荷瘤裸鼠及MDA-MB-231荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)的HER2表達(dá)情況，探討99Tcm標(biāo)記ZHER2：V2分子影像探針對HER2高表達(dá)乳腺癌的診斷價值。
　　方法：
　　1.分子探針的合成：通過Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZH

4、ER2:V2親和體，并在其C末端連接1個由4個氨基酸(-G(Gly)GGC(Cys))組成的類似N3S結(jié)構(gòu)的短肽，作為該分子探針的雙功能螯合劑（Bi-Functional Chelating Agent,BFCA），并利用配體交換法與核素99Tcm進(jìn)行標(biāo)記。
　　2.分子探針的標(biāo)記率：應(yīng)用反相高效液相色譜法(reverse-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)

5、測定99Tcm-ZHER2:V2分子探針的標(biāo)記率。
　　3.體外穩(wěn)定性測定：將該分子探針分別與生理鹽水及人新鮮血清等體積混合，并于恒溫水浴環(huán)境中（37℃）孵育1、2、4、6、12、24h，并應(yīng)用RP-HPLC法分別測定其在以上各時間點該兩種介質(zhì)中的放化純。
　　4.細(xì)胞培養(yǎng)：采用靜置貼壁法培養(yǎng)人乳腺癌BT474腫瘤細(xì)胞以及人乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞，收集處于對數(shù)生長期的該兩種細(xì)胞用于實驗。
　　5.細(xì)胞攝取、

6、滯留、內(nèi)化、阻斷實驗：將人乳腺癌BT474腫瘤細(xì)胞和人乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞分別以6×105個/孔的密度接種于六孔板內(nèi)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h達(dá)到單層亞融合狀態(tài)時進(jìn)行細(xì)胞的攝取、滯留、內(nèi)化及阻斷實驗，研究該分子探針在上述 BT474細(xì)胞以及MDA-MB-231細(xì)胞中的細(xì)胞攝取、滯留、內(nèi)化及阻斷情況，以了解該分子探針在體外的藥代動力學(xué)及特異性。
　　6構(gòu)建荷瘤裸鼠模型：將人乳腺癌BT474腫瘤細(xì)胞以及人乳腺癌MDA-MB-

7、231腫瘤細(xì)胞分別接種于無特定病原體（specific pathogen free， SPF）級BALB/c裸鼠右前肢外側(cè)皮下，待腫瘤直徑長置約1.0cm滿足實驗要求時，即建模成功。取同種腫瘤大小無明顯差異，外觀飽滿、紅潤、無壞死的荷瘤裸鼠用于實驗。
　　7.體內(nèi)穩(wěn)定性檢測：收集尾靜脈注入99Tcm-ZHER2:V2分子探針后1.5~2h內(nèi)的尿液，應(yīng)用RP-HPLC法測定尿液中的放射性化學(xué)純度。
　　8.體內(nèi)分布實驗：取16

8、只人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型，利用隨機(jī)數(shù)字表法等分為4組，經(jīng)尾靜脈注射99Tcm-ZHER2:V2分子探針后1、2、4、6h取一組動物模型，眼靜脈取血后，頸椎脫臼處死，即刻取出其腎、肝、心、脾、胃、肺、小腸、血液、肌肉、骨骼、腦、腫瘤，稱重并測定其相應(yīng)器官或組織的放射性計數(shù)，測定標(biāo)準(zhǔn)源（n=3）的放射性計數(shù)后，計算出每克組織中的放射性計數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)源的比值，即每克組織的百分注射劑量率（percentage activity o

9、f injection dose per gram of tissue，％ID/g）以及腫瘤與肌肉組織的%ID/g比值(tumor to muscle, T/M)。研究各時間點該分子探針在人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠動物模型的體內(nèi)分布情況。
　　9.荷瘤裸鼠顯像：取HER2高表達(dá)人乳腺癌BT474荷瘤裸鼠以及HER2低表達(dá)人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠模型各5只，經(jīng)尾靜脈注射99Tcm-ZHER2:V2分子探針，于注

10、藥后1、2、4、6h行SPECT靜態(tài)顯像，觀察各組內(nèi)腫瘤部位放射性濃聚情況隨時間的變化以及同一顯像時間點兩組間不同荷瘤裸鼠腫瘤部位放射性濃聚的差異；另再取人乳腺癌BT474荷瘤裸鼠及MDA-MB-231荷瘤裸鼠各1只，在注射99Tcm-ZHER2:V2分子探針前，注射過量未標(biāo)記核素的ZHER2:V2親和體后同樣按照1、2、4、6h行SPECT靜態(tài)顯像，進(jìn)行阻斷特異性研究，觀察同組內(nèi)腫瘤部位不同時間的放射性濃聚情況以及同種荷瘤裸鼠模型阻斷

11、與未阻斷之間同一時間點濃聚情況的不同。
　　10.病理學(xué)檢測：對本實驗所用的人乳腺癌BT474腫瘤細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞和BT474荷瘤裸鼠腫瘤組織、MDA-MB-231荷瘤裸鼠的腫瘤組織做免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry）來檢測HER2的表達(dá)情況。
　　11.統(tǒng)計學(xué)處理：本研究所有計量資料實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。對兩

12、組間實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本t檢驗(或t'檢驗)或Wilcoxon秩和檢驗；每組內(nèi)實驗數(shù)據(jù)多重比較采用 One-Way ANOVA中的S-N-K法或非參數(shù)檢驗中的Krustal-Wallis H檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.99Tcm-ZHER2:V2分子探針的質(zhì)量控制：分子探針放射峰保留時間為13.68min，室溫靜置20min測其放化純?yōu)椋?9.49±0.01）%（n=6）。該分子探針在生理鹽水

13、及人新鮮血清中孵育24h內(nèi)的放化純均在91%以上，且放射峰的位置穩(wěn)定，與孵育前相比未見明顯漂移；HPLC法測得注射分子探針后1.5-2h荷瘤裸鼠的尿液，主峰的放化純?nèi)詾?4.78%，僅小部分在體內(nèi)代謝。
　　2.細(xì)胞實驗:
　　1)攝取實驗：人乳腺癌HER2高表達(dá)BT474腫瘤細(xì)胞在1、2、4、6、12、24h各時間點的摂取率分別為（4.86±0.60）%、（5.62±0.37）%、（44.18±6.40）%、（60.85±

14、1.51）%、（58.76±6.32）%、（58.35±2.08）%，人乳腺癌MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞在以上各時間點的細(xì)胞摂取率分別為（2.46±2.60）%、（3.75±0.71）%、（3.80±1.60）%、（5.38±1.21）%、（4.29±1.60）%、（3.56±0.60）%。人乳腺癌HER2高表達(dá)BT474細(xì)腫瘤胞各時間點的攝取率均明顯高于人乳腺癌HER2低表達(dá)MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞（t=4.037~59.169

15、,均P<0.05），且兩者整體呈上升趨勢，至6h達(dá)到最大值，之后保持穩(wěn)定，達(dá)到一個平臺期。
　　2)滯留實驗：分子探針在該兩種腫瘤細(xì)胞內(nèi)滯留率均較高，BT474及MDA-MB-231細(xì)胞1h的滯留率分別可達(dá)到（89.74±2.48）%、（74.31±1.31）%，各時間點的滯留率 BT474腫瘤細(xì)胞均高于MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞，且1-6小時下降較快，之后隨時間延長滯留率下降緩慢，并逐漸保持在一個相對穩(wěn)定的水平。
　　3

16、)內(nèi)化實驗：隨著時間延長內(nèi)化率整體呈上升趨勢，BT474腫瘤細(xì)胞各時間點的內(nèi)化率明顯高于MDA-MB-231細(xì)胞。
　　4)阻斷實驗：BT474腫瘤細(xì)胞與 MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞在加入99Tcm-ZHER2:V2分子探針之前，分別加入500倍及1000倍過量的未標(biāo)記核素的ZHER2:V2親和體對HER2靶點進(jìn)行阻斷、封閉，BT474腫瘤細(xì)胞及MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞的4h攝取率及被500倍、1000倍未標(biāo)記核素的親和體阻

17、斷后的細(xì)胞攝取率分別為（44.18±6.40）%、（5.28±2.33）%、（2.29±0.83）%；（3.67±0.73）%、（1.90±1.00）%、（1.21±0.48）%。兩種腫瘤細(xì)胞阻斷后的細(xì)胞攝取率與未阻斷前相比均顯著下降（F=104.524，P<0.05；F=9.063，P<0.05）。
　　3.荷瘤裸鼠體內(nèi)分布：除腎臟外，99Tcm-ZHER2:V2分子探針在人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)分布較高，

18、在1、2、4、6h腫瘤組織的%ID/g(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為（1.73±0.17）、（1.94±0.13）、（3.11±0.11）、（2.56±0.12），在4h達(dá)到峰值；探針經(jīng)腎臟排泄，在腎臟部位的聚集隨著時間的延長，排泄迅速，由1h的（6.46±1.01）下降到6h的（2.14±0.41）。此外，99Tcm-ZHER2:V2分子探針在其余正常組織或器官中均濃聚不明顯，且隨著時間的延長，濃聚呈下降趨勢。
　　4.荷瘤裸鼠SPEC

19、T顯像：人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠注射99Tcm-ZHER2:V2分子探針1h腫瘤組織即有明顯的放射性核素攝取，且隨時間的延長濃聚程度逐漸增加，4h達(dá)攝取高峰，6h稍見降低；人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠在注射該分子探針后1h腫瘤部位可見輕度放射性核素攝取，4h時顯影較明顯，之后稍降低，各時間點腫瘤部位放射性濃聚程度均明顯低于BT474荷瘤裸鼠。各時間點T/NT比值BT474荷瘤裸鼠模型組明顯高于MDA-MB-231荷瘤

20、裸鼠模型組（t=23.023~26.314， t′=-22.808，Z=-2.887，P<0.05）。阻斷組人乳腺癌BT474荷瘤裸鼠與人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠腫瘤部位的T/NT比值均較未阻斷組明顯下降（t′=27.838~30.343，Z=-2.882，P<0.05； t=7.704~8.864，t′=8.896， Z=-2.882，P<0.05）。
　　5.病理學(xué)分析：人乳腺癌BT474荷瘤裸鼠腫瘤組織免疫組織化學(xué)

21、染色為強(qiáng)陽性（++++），而人乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠腫瘤組織免疫組織化學(xué)染色為弱陽性（﹣或+）。人乳腺癌BT474細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色為強(qiáng)陽性（++++），而人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色為陰性或者弱陽性（﹣或+）。
　　結(jié)論：
　　99Tcm-ZHER2:V2分子影像探針的標(biāo)記方法簡便，標(biāo)記率高，無需進(jìn)一步純化即可用于顯像，且體內(nèi)外穩(wěn)定性好，能夠被HER2高表達(dá)人乳腺癌BT474腫瘤細(xì)胞以及B