99Tcm標(biāo)記EGFR小分子靶向結(jié)合蛋白顯像的實驗研究.pdf

1、目的:制備99Tcm標(biāo)記的表皮生長因子受體(epidermal growth factorreceptor, EGFR)小分子靶向結(jié)合蛋白ZEGFR∶1907分子探針，評價其體內(nèi)外穩(wěn)定性，分析該分子探針與細胞EGFR的體外靶向結(jié)合能力，研究分子探針在不同EGFR表達水平荷瘤裸鼠體內(nèi)分布和體內(nèi)顯像，并進行相應(yīng)對比分析，探討其對EGFR高表達腫瘤早期、特異性診斷的可行性。
　　方法:采用Fmoc/tBu多肽固相合成法合成ZEGFR∶1

2、907，于其N末端連接4個氨基酸[Gly-(D)Ala-Gly-Gly-]作為螯合劑，其可形成類似N4結(jié)構(gòu)的強螯合基團，為了消除其分子基團間的空間阻礙，引入1個γ-氨基丁酸(4-aminobutyric acid， Aba)作為隔離物，得到化學(xué)結(jié)構(gòu)為Gly-(D)Ala-Gly-Gly-Aba-ZEGFR∶1907的小分子靶向結(jié)合蛋白，再應(yīng)用配體交換法進行核素99Tcm標(biāo)記，最終制備形成99Tcm標(biāo)記的EGFR小分子靶向結(jié)合蛋白ZEGF

3、R∶1907分子探針（簡寫為99Tcm-ZEGFR∶1907）。采用反相高效液相色譜法（reverse-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)測定其不同時間點的標(biāo)記率及在生理鹽水與人新鮮血清兩種介質(zhì)中37℃條件下孵育不同時間后的放化純，以監(jiān)測其體外穩(wěn)定性。采用靜置貼壁法在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)EGFR高表達的人卵巢癌SKOV3細胞與EGFR低表達的人乳腺癌MDA-MB-

4、435S細胞，取對數(shù)生長期的人卵巢癌SKOV3細胞用RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute1640)培養(yǎng)液制成單細胞懸液，注射于每只BABL/c裸鼠的右前肢外側(cè)皮下，每只裸鼠注射0.2ml，約1×107個細胞，SPF級(specific pathogen free，無特定病原體)環(huán)境下飼養(yǎng)，約4～5周腫瘤長至直徑約1～1.5cm時，即建成EGFR高表達的人卵巢癌SKOV3細胞荷瘤裸鼠模型。此外，

5、用同樣的方法建立EGFR低表達的人乳腺癌MDA-MB-435S細胞荷瘤裸鼠模型。用RP-HPLC法測定SKOV3荷瘤裸鼠體內(nèi)注射99Tcm-ZEGFR∶1907分子探針后2-3h內(nèi)尿液中該分子探針的放化純，監(jiān)測其體內(nèi)穩(wěn)定性。進行EGFR高表達的人卵巢癌SKOV3與EGFR低表達的人乳腺癌MDA-MB-435S細胞兩種腫瘤細胞對99Tcm-ZEGFR∶1907的體外攝取和滯留實驗，分析EGFR與99Tcm-ZEGFR∶1907的體外靶向結(jié)

6、合能力。另外，阻斷實驗中，在向SKOV3細胞中加入99Tcm-ZEGFR∶1907前20min先加入過量的未標(biāo)記的ZEGFR∶1907進行阻斷，研究EGFR與99Tcm-ZEGFR∶1907結(jié)合的體外靶向性。體內(nèi)分布研究中取兩種荷瘤裸鼠模型各16只，分別隨機分成四組，每組4只，分別于尾靜脈注射約37KBq/150ul分子探針99Tcm-ZEGFR∶1907后1、2、4、6h經(jīng)眼靜脈采血后，頸椎脫臼處死，即刻取出荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、

7、腎、胃、小腸、腦、骨骼、肌肉、腫瘤組織分別稱重并測量其放射性計數(shù)，同時測量標(biāo)準(zhǔn)源的放射性計數(shù)，計算不同時刻每克組織的百分注射劑量率(percentage activityof injection dose per gram of tissue，％ID/g)及腫瘤/肌肉的(tumor to muscle，T/M)％ID/g比值。另取4只SKOV3荷瘤裸鼠在注射分子探針99Tcm-ZEGFR∶1907前2h先注射100倍過量未標(biāo)記的ZEGF

8、R∶1907進行阻斷，4h后再進行體內(nèi)分布研究。比較不同時間點及兩種模型間分子探針99Tcm-ZEGFR∶1907在體內(nèi)分布的差異，并分析阻斷和非阻斷處理所產(chǎn)生的差異。體內(nèi)顯像研究中取兩種荷瘤裸鼠模型各5只，分別于尾靜脈注射分子探針99Tcm-ZEGFR∶19070.1ml約37MBq(1mCi)后1、2、4、6、8、10h分別上機顯像，為了研究分子探針體內(nèi)顯像特異性，另取人卵巢癌SKOV3細胞荷瘤裸鼠模型5只，在注射分子探針99Tcm

9、-ZEGFR∶1907前2h先于尾靜脈注射100倍過量的未標(biāo)記的EGFR小分子靶向結(jié)合蛋白ZEGFR∶1907(500μg)進行阻斷，然后再分別于注射分子探針后1、2、4、6、8、10h顯像。觀察荷瘤裸鼠腫瘤部位放射性濃聚的情況，對比觀察阻斷與非阻斷處理所產(chǎn)生的差異，并用感興趣區(qū)(ROI)技術(shù)計算不同時間點腫瘤部位與對側(cè)同等位置、同等大小非腫瘤部位放射性計數(shù)的比值，即T/NT比值(target tonon-target ratio)，比

10、較兩種模型腫瘤部位放射性濃聚的差異。采用SAS9.1統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對數(shù)據(jù)進行兩樣本t檢驗（或t'檢驗）或Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:分子探針99Tcm-ZEGFR∶1907經(jīng)HPLC測定放射峰呈單峰，保留時間約為23min，即刻標(biāo)記率高，為96.485±1.42％。6h以內(nèi)標(biāo)記物的標(biāo)記率仍＞95％，且保留時間固定，未見漂移。在生理鹽水

11、及人新鮮血清中37℃恒溫孵育后，6h內(nèi)分子探針標(biāo)記率均＞90％，且保留時間均較固定，未見漂移。分子探針由尾靜脈注入荷SKOV3細胞裸鼠體內(nèi)后1小時取到裸鼠尿液，離心后取上清液于不同時間點用RP-HPLC測定放化純，4小時內(nèi)均在80％以上，尿液放射峰出現(xiàn)時間主要在約23min處，其前面約19min處出現(xiàn)一小代謝物峰，沒有游離99TcmO4-出現(xiàn)。
　　人卵巢癌SKOV3細胞對99Tcm-ZEGFR∶1907的體外攝取率除1h(t=0

12、.32,P=0.7573＞0.05)外，均高于人乳腺癌MDA-MB-435S細胞(t=3.28-24.05，t'=16.21，Z-2.80，均P＜0.05)，且在12h時達到最大值，為9.99％，之后略降低，但變化不大。各個時間點99Tcm-ZEGFR∶1907在SKOV3細胞中的滯留率均高于MDA-MB-435S細胞(t=18.38-39.85，均P＜0.0001)，且隨時間延長滯留率下降減慢，并逐漸達到一個相對穩(wěn)定的水平。阻斷組SK

13、OV3細胞在加入99Tcm-ZEGFR∶1907前20min加入過量的未標(biāo)記的ZEGFR∶1907后，4h時的細胞攝取率從（5.52±0.43）％降到了(2.69±0.26)％，有顯著性差異(t=13.67，P＜0.0001)。
　　荷瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果表明99Tcm-ZEGFR∶1907在EGFR高表達SKOV3荷瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)分布較高，其T/M比值由1h的（2.60±0.06）增長至6h的（7.05±0.14），腎臟中的放射

14、性分布最高，其次為肝臟。此外，除肝臟和腎臟外，99Tcm-ZEGFR∶1907在大部分正常組織或器官中被快速清除。EGFR高表達SKOV3荷瘤裸鼠各時間點的T/M比值均高于EGFR低表達MDA-MB-435S荷瘤裸鼠（Z=2.00-2.01，均P＜0.05）。阻斷處理后體內(nèi)分布4h時的T/M比值由4.95±0.09降到了1.34±0.04，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.0016, P=0.0453＜0.05)。
　　荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像結(jié)

15、果示，SKOV3荷瘤裸鼠體內(nèi)顯像1h時腫瘤部位即可見放射性核素聚集，且隨著時間延長，放射性聚集程度逐漸增加，T/NT比值10h時最高(6.61±0.09)。然而，EGFR低表達的MDA-MB-435S荷瘤裸鼠及阻斷組SKOV3荷瘤裸鼠腫瘤部位始終未見明顯放射性核素聚集，T/NT值均低于未阻斷的SKOV3荷瘤裸鼠，各時間點均具有顯著性差異(均P＜0.0001)。
　　結(jié)論:99Tcm標(biāo)記的EGFR小分子靶向結(jié)合蛋白ZEGFR∶190