TNFR放射性配體99Tcm-TP1093的制備及其荷瘤動物顯像研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　腫瘤壞死因子α(TNFα,簡稱TNF)是一種多功能細胞因子,由單核細胞、巨噬細胞或淋巴細胞分泌產(chǎn)生,在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、微生物與寄生蟲感染等方面起重要作用。TNF通過靶細胞膜表面TNF受體(TNFR)介導(dǎo)發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究證實,TNFR在包括惡性淋巴瘤、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞表面呈高水平表達;重組改構(gòu)的人TNF(rmhTNF)在體內(nèi)、外能夠特異性殺傷腫瘤細胞,而對正常組織

2、細胞則無明顯的毒副作用,并已在國內(nèi)外用于臨床治療腫瘤。因此,TNFR是一潛在的腫瘤分子影像和生物治療研究的理想靶標。
　　Thr-Ala-Gln-Ser-Ala-Tyr(TAQSAY)是通過噬菌體肽庫展示技術(shù)篩選得到的靶向TNFR1胞外區(qū)的高選擇性、高親和力六肽。分別在六肽的氨基末端和羧基末端添加丙氨酸(Ala)與甘氨酸(Gly)殘基,所得ATAQSAYG八肽能更好地模擬在相應(yīng)目標噬菌體外殼表達的外源性插入的TAQSAY六肽構(gòu)像;

3、實驗顯示,ATAQSAYG八肽能夠有效抑制培養(yǎng)的TNFR陽性腫瘤細胞增殖。
　　本課題擬通過化學(xué)修飾合成G(D)AGG-Aba-ATAQSAYG-NH2(TP1093),利用其中的G(D)AGG四肽作為雙功能螯合劑,實現(xiàn)對ATAQSAYG的99Tcm間接標記,制備標記率符合顯像要求的99Tcm-TP1093,探討其作為TNF受體陽性實體腫瘤分子顯像劑的可行性,拓展腫瘤分子影像研究的新途徑。
　　研究方法:
　　1.99

4、Tcm-TP1093的制備:化學(xué)合成G(D)AGG-Aba-ATAQSAYG-NH2(TP1093,純度98.81％),其中G(D)AGG為雙功能螯合劑。99Tcm標記TP1093:雙蒸水溶解多肽,SnCl2作為還原劑,反應(yīng)體系為弱堿性(pH約為10),加入新鮮淋洗的99TcmO4-、充氮密封,室溫震蕩30min,反應(yīng)完成后加入NaH2PO4將標記溶液pH調(diào)至中性。
　　2.99Tcm-TP1093理化性質(zhì)鑒定:①上行紙層析法測定

5、計算標記率與比活度,并評價體外穩(wěn)定性,展開劑分別為氨水系統(tǒng)和丙酮;②人血清蛋白結(jié)合實驗,經(jīng)SephadexG-50柱層析,評價標記多肽與血漿蛋白的結(jié)合能力;③脂/水分配實驗評價標記多肽的親脂/親水性。
　　3.健康家兔體內(nèi)顯像:經(jīng)耳緣靜脈注射99Tcm-TP1093,SPECT顯像定性觀察組織器官的放射性動態(tài)分布變化,利用ROI技術(shù)分析重要組織器官的時間-放射性曲線(TAC)。
　　4.健康家兔體內(nèi)示蹤動力學(xué)實驗:取家兔9只

6、,經(jīng)耳緣靜脈各注射200μl(74MBq)99Tcm-TP1093,分別于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480min從對側(cè)耳緣靜脈采血、稱重,γ免疫計數(shù)儀測量放射性計數(shù)(cpm),經(jīng)參考標準源校正后計算血液放射性濃度(KBq/L)。應(yīng)用代謝動力學(xué)軟件(DAS3.1.0版),對健康家兔體內(nèi)平均血液放射性濃度-時間數(shù)據(jù)分別進行一、二、三室模型曲線擬合,結(jié)合實測值與擬合不同室模型計算值間的比較及TNFR在正常體內(nèi)的表達實際

7、,對房室模型進行綜合分析判斷。
　　5.正常小鼠體內(nèi)分布實驗:30只昆明小白鼠隨機表法分6組,每組5只,每只經(jīng)尾靜脈注射0.1ml(7.4MBq)99Tcm-TP1093,分別于注射后1、10、30、60、120、240min按組將實驗小鼠斷頸處死,取血及主要臟器組織,稱重并測量其放射性計數(shù)(cpm),經(jīng)參考源校正后計算每克組織攝取放射性活度占注入放射性總活度的百分數(shù)(ID%/g)。
　　6.荷瘤裸鼠顯像及競爭結(jié)合顯像:經(jīng)荷

8、瘤裸鼠尾靜脈注射99Tcm-TP1093100μl(7.4MBq),仰臥位固定于SPECT探頭下方進行顯像,觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤組織及其他組織器官放射性的動態(tài)分布變化,利用ROI技術(shù)測定腫瘤與對側(cè)軟組織的T/NT放射性比值。并用同樣的方法進行TP1093與99Tcm-TP1093在荷瘤裸鼠體內(nèi)的競爭結(jié)合顯像,觀察TP1093對腫瘤組織對99Tcm-TP1093攝取的影響,評價99Tcm-TP1093與腫瘤組織的TNFR結(jié)合特性。

9、　　實驗結(jié)果:
　　1.標記率與比活度:99Tcm-TP1093的標記率為(97.18±0.9)%,比活度(15.9±0.6)TBq/mmol。
　　2.理化性質(zhì):標記多肽室溫放置4h,99Tcm-TP1093的放化純度仍有(93.34±0.91)%;SephadexG-50柱層析,99Tcm-TP1093與血清蛋白無明顯結(jié)合;脂/水分配系數(shù)lgP為-(1.68±0.09)。
　　3.體內(nèi)示蹤動力學(xué):99Tcm-TP1

10、093在健康家兔體內(nèi)的動力學(xué)過程符合權(quán)重為1/c的二室模型,t1/2α為(2.68±0.54)min,t1/2β為(69.15±20.34)min,總清除率(CL)為(5.02±4.38)mL/kg。
　　4.正常小鼠體內(nèi)分布和健康家兔顯像:靜脈注射99Tcm-TP1093后,血液放射性清除迅速,軟組織放射性消退快;整個顯像過程胃區(qū)呈放射性缺損,甲狀腺區(qū)未見異常放射性濃聚,腦呈低放射性分布;體內(nèi)放射性主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排泄,少量通過肝

11、膽系統(tǒng)分泌。
　　5.荷瘤裸鼠SPECT顯像:注射后0.5h腫瘤清晰顯影,T/NT值為達5.14。注射非標記多肽后,腫瘤影像明顯減弱,0.5hT/NT值為2.52,抑制率約為49%。
　　結(jié)論:
　　1.本研究成功制備標記率高(97.18±0.9)%、穩(wěn)定性好的99Tcm-TP1093,標記方法簡便,常溫下即可完成,無需分離純化,易于制備成一步法標記凍干試劑盒。
　　2.99Tcm-TP1093體內(nèi)外穩(wěn)定性好,具