放射性核素顯像監(jiān)測(cè)肺癌多藥耐藥狀態(tài)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:肺癌是發(fā)達(dá)國家的主要腫瘤，在我國，特別是大中城市的發(fā)病率逐年上升。上海市最新統(tǒng)計(jì)，肺癌發(fā)病率占惡性腫瘤發(fā)病率的第1位。雖然外科手術(shù)結(jié)合放、化療的綜合治療使肺癌的療效有所提高，但遠(yuǎn)期療效仍不佳。這除了肺癌出現(xiàn)癥狀較晚，發(fā)現(xiàn)較晚以外，肺癌對(duì)化療的耐藥性也是重要原因之一。腫瘤的耐藥現(xiàn)象，主要有原發(fā)性耐藥和臨床上較為常見的多次化療后所出現(xiàn)的獲得性耐藥。 肺癌耐藥性的產(chǎn)生有多種機(jī)理，P糖蛋白(P-glycprotin，P-gp)和多

2、藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrugresistance-associatedprotein，MRP)相關(guān)的多藥耐藥是肺癌耐藥的機(jī)理之一。P糖蛋白具有“藥物泵”的功能，對(duì)各種藥物進(jìn)入細(xì)胞和從細(xì)胞內(nèi)清除起重要作用。它與各種植物類和抗生素類抗癌藥物耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，而對(duì)此類耐藥性的檢測(cè)仍是臨床上一個(gè)難以解決的問題。 目前，檢測(cè)P-gp的方法有免疫組化法、PCR(多聚酶鏈反應(yīng))、Westemblot法、放免自顯像法、流式細(xì)胞術(shù)等。這

3、些技術(shù)均須對(duì)組織活檢，在體外進(jìn)行定性定量分析，具有創(chuàng)傷性，并且受試驗(yàn)精確度、腫瘤樣本差異以及各種技術(shù)的敏感性和特異性的限制；同時(shí)由于對(duì)化療后標(biāo)本的取材不方便，這就在一定程度上影響了對(duì)化療前后腫瘤多藥耐藥狀態(tài)的動(dòng)態(tài)觀察及耐藥調(diào)節(jié)劑有效性的觀察。因此，尋找一種無創(chuàng)、靈敏、可以對(duì)腫瘤化療前后進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察的方法是很有必要的。近來，大量研究發(fā)現(xiàn)，MIBI(甲氧基異丁基異腈)不僅用于心肌顯像和腫瘤顯像，還被認(rèn)為是P-gp底物，可以為P-gp識(shí)別、泵

4、出，從而可用99mTc-MIBI肺腫瘤陽性顯像功能性識(shí)別P-gp，反映腫瘤的耐藥狀態(tài)。MIBI是一種親脂性陽離子復(fù)合物，主要用于心肌彌漫成像。由于其親脂性和正電性，該示蹤劑通過被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入活性細(xì)胞，并濃聚于線粒體內(nèi)膜，而代謝產(chǎn)物琥珀酸鹽增加其與線粒體結(jié)合。在體外實(shí)驗(yàn)中，其攝取和存留與由跨膜電位推動(dòng)的被動(dòng)彌散有關(guān)，凈細(xì)胞攝取量與P-gp的表達(dá)成正比，給予調(diào)節(jié)劑后攝取量明顯增加。從而可以用99mTc-MIBI功能成像的方法無創(chuàng)性地觀察P-g

5、p的表達(dá)狀態(tài)，評(píng)估腫瘤多藥耐藥的狀態(tài)，以及檢測(cè)多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的逆轉(zhuǎn)能力。 該課題通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)99mTc-MIBI腫瘤顯像與腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行了研究，并同時(shí)探討了99mTc-MIBI腫瘤顯像監(jiān)測(cè)維拉帕米逆轉(zhuǎn)肺腺癌多藥耐藥狀態(tài)的可行性，為利用功能顯像無創(chuàng)性監(jiān)測(cè)腫瘤多藥耐藥狀態(tài)探索新的方法。 目的:利用BALB/c裸鼠SPCA-1人肺腺癌移植瘤模型，通過99mTc-MIBI顯像及感興趣區(qū)(regionofinte

6、rest，ROI)半定量分析，觀察應(yīng)用維拉帕米逆轉(zhuǎn)前后，腫瘤多藥耐藥狀態(tài)變化情況，并與流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，以探討應(yīng)用顯像進(jìn)行腫瘤多藥耐藥狀態(tài)監(jiān)測(cè)的可行性。 材料與方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1細(xì)胞在含10μmolL阿霉素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的培養(yǎng)液中呈單層貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)箱為37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2。當(dāng)SPCA-1細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，采用不含阿霉素而含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)

7、7d，常規(guī)消化細(xì)胞，吹打，調(diào)整細(xì)胞濃度至106個(gè)/ml。 2.動(dòng)物模型制備：隨機(jī)選取20只4周齡的雌性BALB/c裸鼠，常規(guī)消毒裸鼠右前肢背部的皮膚，每只裸鼠皮下注射0.2ml～0.3ml細(xì)胞懸液，當(dāng)腫塊直徑長(zhǎng)至1.5cm左右時(shí)進(jìn)行顯像。 3.顯像研究：MIBI藥盒由北京師范大學(xué)師宏藥物中心提供，99mTcO4-淋洗液由中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所提供，按說明書標(biāo)記，標(biāo)記率大于96％。將20只裸鼠隨機(jī)分為維拉帕米逆轉(zhuǎn)

8、組和對(duì)照組，每組10只。兩組均行首次顯像。顯像前腹腔注射8％戊巴比妥鈉0.15ml/20g，使荷瘤裸鼠昏睡，經(jīng)尾靜脈注射99mTc-MIBI7.4MBq，注射后15min，60min，120min分別用SPECT(東芝GCA-901A/HG)采集荷瘤裸鼠后位平面圖像。采集條件：針孔準(zhǔn)直器，矩陣256×256，放大倍數(shù)為3.0，每幀計(jì)數(shù)＞300K。對(duì)照組僅行一次顯像，顯像后立即處死，取腫瘤組織行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)組在第1次顯像后，第2天

9、按0.1mg/g體重對(duì)所有裸鼠均腹腔注射維拉帕米，該劑量分3天注射，在第5天同上方法再次進(jìn)行99mTc-MIBI顯像，顯像后立即處死裸鼠，取腫瘤組織行流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp表達(dá)狀況。利用感興趣區(qū)技術(shù)，在每只裸鼠的靜態(tài)平面圖像上計(jì)算腫瘤與對(duì)側(cè)正常部位的放射性計(jì)數(shù)比(T/N)，比較不同時(shí)間的T/N，同時(shí)計(jì)算120min相對(duì)于15min的核素滯留率，并與流式細(xì)胞儀結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果: 1.顯像特征，逆轉(zhuǎn)組第一次顯像和對(duì)照組顯

10、像15min顯像各有1例裸鼠未能顯示腫瘤，其余均能顯示腫瘤，但圖像較模糊，在60min時(shí)，逆轉(zhuǎn)組有2只裸鼠，對(duì)照組有3只裸鼠不能顯示腫瘤，在120min時(shí)，逆轉(zhuǎn)組有5只裸鼠，對(duì)照組有7只裸鼠不能顯示腫瘤。逆轉(zhuǎn)組在第二次顯像時(shí)，均能顯示腫瘤，且圖像明顯好于第一次顯像。 2.腫瘤攝取比值(TUR)，對(duì)照組與逆轉(zhuǎn)組第二次顯像間、逆轉(zhuǎn)組第一次顯像與第二次顯像間15min、60min以及120min的TUR均有顯著性差異(p＜0.01)。

11、對(duì)照組和逆轉(zhuǎn)組第一次顯像間各時(shí)間點(diǎn)TUR均無顯著性差異(p＞0.05)。各組顯像的15minTUR，60minTUR及120minTUR之間無顯著性差異(p＞0.05)。計(jì)算對(duì)照組、逆轉(zhuǎn)組第一次顯像和第二次顯像120min相對(duì)于15min的滯留率(RI)。對(duì)照組RI與逆轉(zhuǎn)組第一次顯像RI、對(duì)照組RI與逆轉(zhuǎn)組第二次顯像RI、逆轉(zhuǎn)組第一次顯像RI與逆轉(zhuǎn)組第二次顯像RI之間均無顯著性差異(p＞0.05)。 3.逆轉(zhuǎn)前后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，

12、對(duì)照組P-gp蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的百分率為(65.5±25.0)％，逆轉(zhuǎn)組P-gp蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的百分率為(40.2±17.7)％，二者有顯著性差異(p＜0.05)。各時(shí)相的TUR與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的P-gp蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的百分率呈負(fù)相關(guān)(p＜0.05)。RI與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的P-gp蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的百分率無相關(guān)關(guān)系(p＞0.05)。 結(jié)論:99mTc-MIBI顯像與SPCA-1人肺腺癌腫瘤細(xì)胞P-gp的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，可以較好