放射性核素標(biāo)記技術(shù)

1、放射性核素標(biāo)記技術(shù),實(shí)驗(yàn)核醫(yī)學(xué),一.幾個(gè)概念  1.標(biāo)記及標(biāo)記化合物：通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)手段將某種放射性同位素和某種生物活性化合物相連接，使之成為某示蹤物的方法稱(chēng)之為標(biāo)記。其產(chǎn)物稱(chēng)之為標(biāo)記化合物。  2.內(nèi)源性標(biāo)記：在有機(jī)或生物合成過(guò)程中，使放射性前身物摻入到某生物活性分子一級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)的標(biāo)記方法。特點(diǎn)是標(biāo)記化合物和生物活性物質(zhì)理化特性完全相同.  3.理想標(biāo)記：

2、當(dāng)化合物中某原子被相同元素的放射性同位素所取代，而取代后的分子性質(zhì)不發(fā)生改變(如構(gòu)型,旋光性等)這稱(chēng)之為理想標(biāo)記。它和內(nèi)源性標(biāo)記特點(diǎn)相似但方法不同。  4.非理想標(biāo)記：在一定條件下，用組成化合物以外的放射性同位素原子進(jìn)行取代該化合物的某些原子的標(biāo)記稱(chēng)之非理想標(biāo)記。其分子結(jié)構(gòu)或性質(zhì)均較原化合物有不同程度的改變。,5.末端標(biāo)記：用化學(xué)或酶的方法將放射性同位素連接在完整生物活性分子上的方法。 

3、6.雙標(biāo)記：在某生物活性分子中引進(jìn)二種元素同位素原子或同一元素的二種放射性同位素標(biāo)記稱(chēng)之為雙標(biāo)記。如T3，T4分別用125I，131I標(biāo)記觀察脫碘情況。 22Na ，24Na在細(xì)胞內(nèi)外示蹤觀察Na流動(dòng)情況。優(yōu)點(diǎn)：是在同一實(shí)驗(yàn)中可以觀察多種指標(biāo)及代謝變化，排除減少個(gè)體實(shí)驗(yàn)誤差。,7.標(biāo)記化合物的術(shù)語(yǔ)及符號(hào) 1)定位標(biāo)記：以"S"表示,標(biāo)記分子中標(biāo)記的原子局限于分子的指定位置.用以追蹤分

4、子中某原子的去向。 A-X-B +C-X*-D ---------A-X-D +C-X*-B A-X-B +C-X*-D ---------A-X*-D +C-X-B  產(chǎn)物C-X*-B 1式正確. 2)非定位標(biāo)記：標(biāo)記分子中標(biāo)記的原子沒(méi)有特定的位置。 3)均勻標(biāo)記：以"U"表示,指標(biāo)記放射性原子在標(biāo)記物分子中的分布，相對(duì)于分子中所有碳原子而言具有

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)均一性.如U-14C葡萄糖。  4)全標(biāo)記：以"G"表示,通常指在氚標(biāo)記的分子中所有的氫原子位置均被氚所取代，它和均勻標(biāo)記的區(qū)別是：前者指"C"而后者指氚,前者僅表示統(tǒng)計(jì)學(xué)的均一性,而后者則是完全或隨機(jī)取代.如G-3H-膽固醇。,5)準(zhǔn)定位標(biāo)記：以"N"表示,氚原子在預(yù)期標(biāo)記的位置上的分布低于化合物總氚含量的95%。 8.標(biāo)記位置及命

6、名 如 1-14C-醋酸 ←標(biāo)記化合物 ↑ ↖ 標(biāo)記位置 核素,二.放射性同位素的選擇 根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇相應(yīng)的同位素，應(yīng)注意： 1.比放射性:表示單位重量的元素或示蹤所含的放射性多少,以mCi/mmol或MBq/mmol等單位表示。由于放射性同位素的比放射性相差懸殊，所以當(dāng)某示蹤中引進(jìn)相同原子數(shù)目的不同種類(lèi)的放射性同位素，則單位時(shí)間內(nèi)的核衰變數(shù)就有上千，上萬(wàn)倍的差異，可見(jiàn)選用高比放射性的同位素進(jìn)行標(biāo)記

7、有著重要意義。 2.豐度：類(lèi)似于純度的概念，代表了某示蹤物中具有放射性部分的比例。豐度的高低直接或間接地影響標(biāo)記產(chǎn)物的比放射性。 3.半衰期：半衰期對(duì)標(biāo)記反應(yīng)的影響首先是對(duì)比放射性的影響,其次是要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜁r(shí)間而選擇不同半衰期的放射性同位素。 4.穩(wěn)定性和外輻射:標(biāo)記用的放射性同位素應(yīng)有較好的穩(wěn)定性，如131I較125I穩(wěn)定性差，而且有β輻射，所以RIA分析常選用125I標(biāo)記。

8、 5.探測(cè)儀器的計(jì)數(shù)效率:氚標(biāo)記物需要用液閃測(cè)量不僅樣品制備煩瑣，而且儀器計(jì)數(shù)效率低，致使其應(yīng)用受限。 6.標(biāo)記類(lèi)型 同位素交換法、化學(xué)合成法、生物合成法、,三.關(guān)于被標(biāo)記的生物活性物的選擇:  被標(biāo)記的生物活性物是根據(jù)實(shí)驗(yàn)所確定的，但用于標(biāo)記的物質(zhì)必須是高純度，所謂高純度包括兩個(gè)含義： 1.化學(xué)純 2.其中所含的微量雜質(zhì)不干擾實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，就放免而言純品應(yīng)有足夠的免疫純；雜蛋白的摻入可因其

9、被大量標(biāo)記而使標(biāo)記失去意義；類(lèi)似結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)可因和反應(yīng)體系內(nèi)某些物質(zhì)交叉而干擾實(shí)驗(yàn)。,四．標(biāo)記化合物的主要指標(biāo)及檢查方法 1.  核純度：,所需放射性活度核純度%= ×100 樣品總放射性活度半衰期測(cè)定法、能量測(cè)定、2.   放化純度： 特定形態(tài)的放射

10、性活度放化純度%= ×100 樣品總放射性活度 層析法、放射自顯影 、 放射性掃描、HPLC、  分段切取測(cè)量,,,,待測(cè)組分和原點(diǎn)的距離（I）Rf= 流動(dòng)相的前沿和原點(diǎn)的距離（L）,,,,,3)比活度：比活度=放射性活度/單位化學(xué)量*每

11、一種放射性核素都有一個(gè)比活度的理論值比活度λN=0.693N/T1/2 N為一毫克原子（mA）的總原子數(shù)為6.023×1020 =69.6×108/T1/2 GBq/mA 意義是每mA的某核素比活度的理論值，即每分子接上一個(gè)該放射性核素原子的標(biāo)記化合物的比活度理論值。 一些常用放射性核素比活度理論值,五.標(biāo)記方法原料為簡(jiǎn)單化合物如3

12、H2,Ba14CO3,Na125I等1)     同位素交換法,,2)化學(xué)合成法,,3)生物合成法,多肽或蛋白質(zhì)的碘化標(biāo)記  125I-Na在氧化劑的作用下氧化成碘分子,與蛋白質(zhì)或多肽分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用,從而使蛋白或多肽碘化.所以只要含有酪氨酸或人為的接上酪氨酸的化合物均可用放射性碘標(biāo)記,除此而外組氨酸,色氨酸殘基也可生成碘化物.碘化標(biāo)記有一氯化碘法,氯胺-T法,

13、過(guò)氧化物酶法,Iodogen法,電解標(biāo)記法,連接標(biāo)記法等這里僅介紹常用的后四種方法.,一.氯胺-T法.1. 原理: 氯胺-T(對(duì)甲基苯磺胺的N-氯衍生物)是一種較溫和的氧化在水溶液中,產(chǎn)生次氯酸,它可以使陰離子131I,125I在碘化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生一種具有強(qiáng)氧化性的帶正電荷的碘原子對(duì)酪氨酸酚環(huán)上與負(fù)氧(羥基)鄰位的碳進(jìn)行親,電攻擊,或?qū)M胺酸咪唑環(huán)上與負(fù)氮鄰位的碳進(jìn)行親電攻擊,產(chǎn)生取代反應(yīng)而碘化多肽或蛋白質(zhì)

14、.這種取代反應(yīng)在某些情況下可以在組胺酰咪唑基或半胱胺酰巰基上,對(duì)于非肽類(lèi)激素,如甾體激素A環(huán)第二位的氫也可進(jìn)行取代.有關(guān)氯胺-T的作用原理尚不清楚,可能反應(yīng)如下:,,,2.標(biāo)記過(guò)程和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化:(以TSH為例) 1)碘化程序及條件: TSH純品(碘化級(jí)) 2μg 10μl 緩沖液(0.5M PB PH 7.5) 20μl 125I-Na o.5mCi

15、 5μl CL-T 20μg 20μl----------------------------------------- 反應(yīng)45秒 室溫(25℃) 偏重亞硫酸鈉 40μg 80μl----------------------------------------- 然后用Sephadex G-75 (1×20 Cm)分離放射性碘和標(biāo)

16、記蛋白.,,標(biāo)記過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題是:1)被標(biāo)記的純品必須要高純度，高活性通常為碘化級(jí)。 2)PH對(duì)碘化反應(yīng)有著重要影響, 根據(jù)被碘化的蛋白質(zhì)，多肽不同，所需最適PH也不同，一般以中性偏弱堿環(huán)境為宜；為確保反應(yīng)體系維持適當(dāng)?shù)腜H則必須要使用足夠緩沖容量的緩沖液。 3)碘源和氯胺-T的用量：首先注意碘源是豐度，是否有保護(hù)劑(通常為Na2SO3等還原劑)，有無(wú)載體等，實(shí)驗(yàn)中氧化劑的用量遠(yuǎn)大于理論值；當(dāng)有還原劑時(shí)氯胺-T用量較無(wú)還

17、原劑碘源還要相應(yīng)增大；由于氯胺-T的用量也能將蛋白或多肽的巰基氧化；所以標(biāo)記還原性強(qiáng)的蛋白化合物時(shí)氯胺-T的用量亦應(yīng)相應(yīng)增加。氯胺-T的用量有一臨界值,低于此值，氯胺-T用量不足時(shí)標(biāo)記率很低，,而用量過(guò)大不僅無(wú)助于提高標(biāo)記率反而會(huì)明顯降低標(biāo)記化合物的免疫和生物活性。氯胺-T的用量是一實(shí)驗(yàn)值，由于氯胺-T水溶液遇光和空氣很不穩(wěn)定，所以要新鮮配制。 4)溫度對(duì)標(biāo)記的影響：如圖所示：溫度的增加不僅可提高反應(yīng)達(dá)平衡的時(shí)間，而且在

18、不同溫度下反應(yīng)有著不同平衡常數(shù)K值.一般選用20℃，過(guò)高的溫度往往造成純品失活。有人用4℃標(biāo)記是為了降低氯胺-T的副作用。 5)反應(yīng)體積的影響：通常要小于100μl，目的是提高可被碘化的蛋白濃度；以提高碘化率。 6)反應(yīng)時(shí)間：在某一固定的條件下，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間是比較衡定的，氯胺-T法反應(yīng)時(shí)間一般在一分鐘以?xún)?nèi)；和氯胺-T用量一樣增加反應(yīng)時(shí)間非但不能提高碘化率,反而會(huì)因?yàn)榈庠?氧化劑等因素而加大標(biāo)記化合物

19、的損傷；把反應(yīng)時(shí)間控制在最小是合理的。 7)關(guān)于終止反應(yīng)：可通過(guò)擴(kuò)大反應(yīng)體積或用還原劑如偏重亞硫酸鈉，其用量為氯胺-T用量的1-2倍.,二.乳過(guò)氧化物酶法(LPO) 1.  原理: 在含有低濃度的過(guò)氧化氫條件下，乳過(guò)氧化物酶可以使過(guò)氧化氫把負(fù)一價(jià)碘離子氧化成帶正電的碘離子，從而達(dá)到碘化的目的。該方法為一酶促反應(yīng)，底物由過(guò)氧化氫，碘和被標(biāo)記的酚化合物組成。其反應(yīng)如下:,2.LPO和

20、CL-T法的比較: LPO法由于過(guò)氧化氫的濃度低而副反應(yīng)少，其標(biāo)記位點(diǎn)限于LPO能接近的位置，即蛋白分子的表面，遠(yuǎn)離活性中心；有定向特征；其標(biāo)記產(chǎn)物活性保存較好；LPO標(biāo)記主要作用在立體構(gòu)型上有利于酶締合的含有酪氨酰基和少量組氨酸殘基的蛋白或多肽，這和CL-T法相同。二者不同之處是:CL-T法不僅限于分子表面，分子空間因子對(duì)標(biāo)記的影響不大，而后者(LPO)則受分子空間因子影響，CL-T法標(biāo)記咪唑基困難，而LPO可以較容易

21、的標(biāo)記組氨酸，除此而外LPO法可用以標(biāo)記各種細(xì)胞及細(xì)胞膜。,3.LPO法標(biāo)記條件的探討: 1)反應(yīng)溫度的影響：不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容最適溫度各異，通常介于20-37℃，本室選用20℃。 2)反應(yīng)時(shí)間的影響：理論上每克分子酶每分鐘催化6.5×103克分子碘進(jìn)入蛋白。但實(shí)驗(yàn)表明其標(biāo)記率和時(shí)間的相關(guān)曲線類(lèi)似于CL-T法，達(dá)反應(yīng)平衡的時(shí)間遠(yuǎn)大于CL-T法，一般在數(shù)分鐘之內(nèi)。 3)PH的影響

22、：過(guò)氧化物酶在酸性環(huán)境中活性最好，有人認(rèn)為最佳PH以4.5-5為宜。但實(shí)際工作的最佳PH并不盡相同，其范圍在3-8之間，這可能由于在不同PH環(huán)境中蛋白質(zhì)活性基團(tuán)的游離，暴露程度不同有關(guān)。 4)過(guò)氧化物酶的用量：濃度過(guò)低不能有效的碘化，濃度過(guò)高碘利用率增加并不顯著，而且還能造成自身標(biāo)記，通常其用量應(yīng)少于被標(biāo)記蛋白的1-10%。標(biāo)記200μg的IgG酶的用量為25μg。,5)過(guò)氧化氫的用量： 過(guò)氧化氫系強(qiáng)氧化劑

23、，高濃度過(guò)氧化氫(>100μg分子)可抑制過(guò)氧化物酶活性，而且損傷被標(biāo)記蛋白的活性，過(guò)氧化氫濃度過(guò)低致使碘化率太低。一般一克分子的碘用一克分子的過(guò)氧化氫為宜。 該方法另一應(yīng)注意的問(wèn)題是；過(guò)氧化氫不穩(wěn)定需用前稀釋。 為了克服過(guò)氧化氫對(duì)酶和蛋白的損傷作用，有人對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，利用葡萄糖氧化酶和D-葡萄糖相作用緩慢釋放過(guò)氧化氫以減少其抑制和損傷作用。本方法的另一改進(jìn)是將過(guò)氧化物酶偶聯(lián)到Sepharose上，固

24、定化酶有利于克服酶自身標(biāo)記的問(wèn)題?？傊摲椒l件溫和，標(biāo)記損傷小是一較為普遍使用的標(biāo)記方法。,4.LPO法對(duì)脂肪的碘化: LPO法可以碘化標(biāo)記磷酸脂，三丙烯酰甘油脂,游離脂肪酸，溶血磷脂及完整細(xì)胞上的脂質(zhì)，其催化位置在飽和及不飽和脂肪酸上進(jìn)行。5.LPO法標(biāo)記對(duì)活細(xì)胞及細(xì)胞膜的碘化: 由于LPO法標(biāo)記位點(diǎn)僅限于酶分子所能到達(dá)的部位，而細(xì)胞膜表面可供碘化的蛋白質(zhì)分子大量存在，所以嚴(yán)格限制條件可以標(biāo)記活細(xì)胞

25、或細(xì)胞膜(具體方法略)。 注意點(diǎn):1)標(biāo)記物如果作為探針用必須嚴(yán)格限制125I2的生成,防止其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)側(cè).2)碘化細(xì)胞膜時(shí)要先碘化標(biāo)記然后再分離細(xì)胞膜，以消除細(xì)胞的自分解干擾。3)為排除細(xì)胞內(nèi)系統(tǒng)催化的碘化和對(duì)碘氧化的影響，應(yīng)同時(shí)作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。4)可溶性蛋白較膜蛋白更易碘化，所以標(biāo)記前需充分洗滌，并加蛋白水解酶抑制劑。,四.Iodogen法 1.原理:Iodogen(氯甘脲)化學(xué)名稱(chēng)為1,3,4,6-四氯-3α,6

26、α-二苯基甘脲。該物質(zhì)不溶于水，但可溶于氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑。它是一較溫和的氧化劑，其標(biāo)記原理和CL-T法，LPO法相似。,2.特點(diǎn)：Iodogen法實(shí)際上是一固相氧化劑，條件溫和而且易于控制，它既可以象LPO法一樣碘化暴露在外的酪氨酸,組氨酸殘基，也可以象CL-T一樣在碘化酪氨酸殘基時(shí)不受分子空間因素的影響。利用其不溶于水的特點(diǎn)可以簡(jiǎn)便地進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記(方法略)。這一方法目前受到廣泛的應(yīng)用。,三.電解標(biāo)記法

27、 1. 原理： 碘化反應(yīng)在坩堝內(nèi)進(jìn)行，陰陽(yáng)極用半透膜分開(kāi)，陽(yáng)極區(qū)含有被標(biāo)記的蛋白質(zhì)和碘源，控制極間電壓使氧化電勢(shì)高到能使I-氧化成I2，但又低到使任何氨基酸不被氧化，從而達(dá)到碘化的目的。 2.特點(diǎn)：條件溫和，蛋白質(zhì)不和氧化劑接觸損傷小，條件易于控制適合較大量蛋白質(zhì)的碘化，缺點(diǎn)是裝置復(fù)雜，通常被標(biāo)記的蛋白質(zhì)量較大。,四.間接標(biāo)記法 1.原理：這種方法是將*I用CL-T法標(biāo)記到活潑的化學(xué)

28、試劑上，然后將該試劑連接到欲標(biāo)記的分子上，目前較為成熟的是Bolton-Hunter試劑，化學(xué)名為3-(對(duì)-羥基苯)丙酸-N琥珀亞胺酯(HPNS)，首先用CL-T法將HPNS碘化，然后以此?；瘎┡c蛋白質(zhì)分子中的游離氨基酸相縮合而引入蛋白質(zhì)分子中，反應(yīng)如下:,,,2.特點(diǎn)：由于該方法碘化標(biāo)記的不是酪氨酸，而是自由的賴(lài)氨酸殘基，所以特別適用于缺乏酪氨酸或酪氨酸位于活性中心，引入碘后就會(huì)導(dǎo)致失活的蛋白質(zhì)。例如PA(protein A)的4個(gè)酪

29、氨酸殘基有一個(gè)被碘化，則PA將失去結(jié)合IgG的Fc能力，故應(yīng)選用這種方法。這種方法既避免了蛋白質(zhì)與氧化劑的接觸，也不和碘直接接觸；所以損傷最小；缺點(diǎn)是二步反應(yīng)，碘利用率低，標(biāo)記物比活度低，不適用于短肽的標(biāo)記。五.合成法(偶合法)標(biāo)記 用化學(xué)合成法引進(jìn)放射性同位素在3H，14C標(biāo)記中極為普遍。碘標(biāo)記中亦有同樣的應(yīng)用，如欲標(biāo)記T2定位將碘標(biāo)記在3，5內(nèi)環(huán)位置上，由于內(nèi)環(huán)不能發(fā)生置換，取代反應(yīng)。所以首先把酪氨酸碘化

30、成4-羥3-5二碘苯基丙酮酸，然后再和非放射性4-羥3-5二碘苯基丙酮酸偶合，脫鹽再用次磷酸和氫碘酸加熱去掉3',5'位的碘,即得到T2(3,5).該方法的優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行定位標(biāo)記；產(chǎn)率高。,標(biāo)記物的純化  當(dāng)?shù)饣磻?yīng)終止后可選用各種生化或物理方法將被碘化的物質(zhì)和游離碘分離，各種方法原理不同，特性各異要根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況來(lái)選擇。常用的方法有透析、電泳、各種色譜技術(shù)等，透析法簡(jiǎn)單易行，回收率較高。但要注意低

31、溫和在透析袋外加KI載體。對(duì)于某些不穩(wěn)定的標(biāo)記物常用分子篩Sephadex層析，它不僅可分離游離碘，而且還可以將標(biāo)記中的損傷，變性物除去。對(duì)于某些定位標(biāo)記的物質(zhì)，可因碘在不同的位置所致電泳速度不同而借助電泳技術(shù)予分離。,,標(biāo)記物的質(zhì)量鑒定 1.比放射性測(cè)定： 投碘量×碘利用率比放射性(％)=------------------------×100

32、 投蛋白質(zhì)量,比放射性的測(cè)定方法： 1）依上述公式直接計(jì)算，其中碘利用率的計(jì)算方法有:A)有機(jī)酸(如三氯醋酸)沉淀法。B)收集洗脫液并繪出層析譜，然后根據(jù)蛋白質(zhì)峰和游離碘峰計(jì)算碘利用率。C)取小樣作紙層析，根據(jù)掃描圖計(jì)算碘利用率。 2）用該標(biāo)記作放免分析標(biāo)準(zhǔn)曲線，以T/B對(duì)濃度作圖，以交于X軸所代表的該標(biāo)記物質(zhì)量和加入標(biāo)記物的放射性相比(Bq/mol)，即為

33、該標(biāo)記物的比放射性。,3）自身取代法:制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在同等條件下加入一定量的該標(biāo)記物，分離、測(cè)定并計(jì)算其取代比率，求出比放射性。,4)選用和被測(cè)標(biāo)記物能譜相差較大的另一種同位素標(biāo)記該物質(zhì)，以待測(cè)標(biāo)記物作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以另一種示蹤物的不同濃度作為樣品加入反應(yīng)體系，同時(shí)雙道測(cè)定兩種同位素放射性，求其抑制比率，從而計(jì)算其比放射性。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌蟮谋确派湫砸嘤兴煌瑢?duì)RIA高比放射性有利提高方法的靈敏度,但對(duì)RBA標(biāo)記物分子最

34、好是一個(gè)分子標(biāo)記一個(gè)碘原子最為理想。,2.放化純度: 標(biāo)記后要通過(guò)不同的方法將游離碘和被標(biāo)記的蛋白質(zhì)分開(kāi)，分離的效果直接影響放化純度鑒定方法包括各種層析,技術(shù)(常用的柱層析,硅膠板,紙層析等)，電泳等。標(biāo)記貯存一定時(shí)間后由于放射損傷，脫碘等原因引起放化純度下降，須用同樣的方法進(jìn)一步純化，放化純一般應(yīng)>90%。,3.活性鑒定 活性鑒定因不同實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而不同，RIA中主要檢查標(biāo)記物的免疫原性，非特異結(jié)合(NSB

35、)85%。RBA則主要檢查其生物活性，雖然具體指標(biāo)不同，但內(nèi)容基本相同。 4.穩(wěn)定性 導(dǎo)致標(biāo)記的蛋白質(zhì)，多肽生物活性和免疫活性損傷，改變的主要因素有: 1)蛋白質(zhì)分子上碘原子的參入量:由于碘置換到酪氨酸殘基系非同位素的非理想標(biāo)記，所以碘化程度對(duì)其生物活性的改變就有決定的影響，引入碘的數(shù)目越少，活性改變就越小。反之亦然，所以比放射性要控制在一定的范圍。同等的碘參入量對(duì)不同的物質(zhì)所造成的活性改變也不相同，這和蛋

36、白質(zhì)本身的特性及分子量的大小有關(guān)。,,2)酪氨酸在被標(biāo)記物的位置和地位對(duì)標(biāo)記的穩(wěn)定有重要關(guān)系。如前所述，如酪氨酸位于活性中心則碘化很容易造成標(biāo)記物的損傷。 3)氧化反應(yīng)損傷:氧化損傷是由氧化劑和碘分子引起，主要涉及蛋氨酸、色氨酸及二硫鍵。 4)輻射損傷:高比放射性時(shí)射線可引起標(biāo)記物聚合，二硫鍵斷裂致使標(biāo)記物失活，另一方面射線可造成溶液水電離而損傷標(biāo)記物。為此標(biāo)記物需貯存在低溫，有BSA或其它還原劑的