99Tcm-survivin mRNA反義肽核酸在人肺癌A549荷瘤裸鼠體內(nèi)分布及顯像研究.pdf

1、目的：通過(guò)制備99Tcm標(biāo)記的survivin mRNA反義肽核酸(PNA)探針，并進(jìn)行人肺癌A549荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布及基因顯像實(shí)驗(yàn)，觀察反義探針在荷瘤裸鼠體內(nèi)分布情況及在腫瘤組織部位的放射性聚集程度，探討基因顯像早期診斷腫瘤的可行性，為核素基因顯像技術(shù)在腫瘤早期診斷方面進(jìn)一步臨床性研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 方法：選用survivin mRNA的第240-251位寡核苷酸片段為靶序列，利用化學(xué)合成法合成與其互補(bǔ)的反義肽核酸片

2、段5’-CCCAGCCTTCCA-3’，于5’端連上4個(gè)氨基酸組成的短肽結(jié)構(gòu)(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly-)，形成1個(gè)類似N4結(jié)構(gòu)的強(qiáng)螯合基團(tuán)，為消除空間阻礙，引入1個(gè)Υ-氨基丁酸(Aba)作為隔離物，然后利用配體交換法進(jìn)行99Tcm標(biāo)記。以同樣方法對(duì)無(wú)義肽核酸片段5’-TACCGTCTGCGA-3’進(jìn)行99Tcm標(biāo)記。采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，測(cè)定標(biāo)記物的保留時(shí)間及放射性化學(xué)純度。以純乙腈為展開(kāi)劑，分

3、別用聚酰胺凝膠膜和快速硅膠紙兩種快速薄層層析法(ITLC)對(duì)標(biāo)記物即刻標(biāo)記率進(jìn)行綜合測(cè)定，并測(cè)定與人新鮮血清37℃保溫24小時(shí)后的標(biāo)記率，檢測(cè)探針的體外穩(wěn)定性。采用貼壁法培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備成1×107個(gè)/0.2ml生理鹽水的單細(xì)胞懸液，接種到4周齡的雌性裸鼠的右前肢皮下，約14天后成瘤，待腫瘤直徑長(zhǎng)至1～1.5cm時(shí)，選取腫瘤形態(tài)規(guī)則，色澤紅潤(rùn)，中心無(wú)壞死的荷瘤裸鼠納入實(shí)驗(yàn)。利用Rt-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人肺癌

4、A549細(xì)胞及腫瘤組織中survivin基因mRNA的表達(dá)情況。細(xì)胞攝取率及滯留率實(shí)驗(yàn)初步探討反義肽核酸在肺癌A549細(xì)胞中的藥代動(dòng)力學(xué)作用。抽取30只荷瘤裸鼠，隨機(jī)分為反、無(wú)義體內(nèi)分布組，每組又分為1、2、4h三個(gè)亞組，各5只，每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射99Tcm標(biāo)記的survivin mRNA反義或無(wú)義PNA(740kBq/0.1ml)后，分別于1、2、4h將對(duì)應(yīng)各組荷瘤裸鼠眼靜脈采血，處死并解剖各組織或臟器，分別測(cè)定血液、心臟、肝臟

5、、脾臟、腎臟、肺臟、胃、腸道、腦、骨骼、肌肉及腫瘤等組織的重量及放射性計(jì)數(shù)，并測(cè)定相同時(shí)刻標(biāo)準(zhǔn)源的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織中放射性計(jì)數(shù)占標(biāo)準(zhǔn)源總放射性計(jì)數(shù)的比值(％ID/g)，計(jì)算腫瘤組織與肌肉組織的％ID/g的比值(T/M)。抽取A549荷瘤裸鼠10只，隨機(jī)分為反、無(wú)義兩組，各5只，每只荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射99Tcm標(biāo)記的survivin mRNA反義或無(wú)義PNA(37MBq/0.1ml)后，進(jìn)行1、2、4h上機(jī)顯像，觀察兩組間顯像的

6、差異。利用感興趣區(qū)技術(shù)(ROI)測(cè)得腫瘤組織與對(duì)側(cè)正常組織的放射性計(jì)數(shù)的比值(T/NT)。所有計(jì)量資料均以x±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行兩個(gè)樣本的成組t檢驗(yàn)，P＜0.05統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。
　　 結(jié)果：99Tcm-survivin mRNA反義PNA經(jīng)HPLC檢測(cè)標(biāo)記物呈單峰，保留時(shí)間約為12分鐘，與survivin mRNA反義PNA的紫外峰保留時(shí)間基本一致。兩種ITLC法綜合檢29Tcm-surv

7、ivin mRNA反義PNA即刻標(biāo)記率為95.48％±1.92％(n=5)，與人新鮮血清37℃保溫24小時(shí)后標(biāo)記率仍＞85％。無(wú)義PNA即刻標(biāo)記率及體外穩(wěn)定性與反義PNA基本相同。
　　 Rt-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人肺癌A549細(xì)胞及腫瘤組織中均高表達(dá)survivin基因。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示A549細(xì)胞對(duì)兩種肽核酸的攝取無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，腫瘤細(xì)胞與反義肽核酸在相互作用1h后有一個(gè)較穩(wěn)定的平臺(tái)期。3h內(nèi)細(xì)胞對(duì)兩種肽核酸都有一定的清

8、除作用，無(wú)義組較反義組清除快，兩組在60及120分鐘時(shí)細(xì)胞滯留率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 荷瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果表明99Tcm-survivin mRNA反義PNA在腫瘤組織內(nèi)分布明顯高于肌肉組織。此外，腎臟和肝臟中的放射性分布最高。反義組1、2、4h腫瘤組織的％ID/g分別為2.51士1.20、1.52士0.16、1.35士0.27。計(jì)算反義、無(wú)義兩組各時(shí)刻T/M值，組間結(jié)果顯示4h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 反義基因顯

9、像顯示99Tcm-survivin mRNA反義PNA在腫瘤部位特異性聚集，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，聚集程度也相對(duì)逐漸增加，4h時(shí)腫瘤組織部位顯像最清晰。利用ROI技術(shù)測(cè)得的1、2、4h小時(shí)T/NT值分別為2.70士0.28、3.44士0.35、4.21±0.63。此外荷瘤裸鼠腹腔有一定的放射性聚集。無(wú)義PNA在腫瘤部位中僅稍有放射性核素聚集，顯像過(guò)程中聚集程度變化不明顯。4h時(shí)反義、無(wú)義兩組間T/NT值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與體內(nèi)分布中T/M比值