rmFⅦ-Gen復合物靶向TF治療腫瘤的實驗研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文rmFⅦGen復合物靶向TF治療腫瘤的實驗研究姓名：楊崢嶸申請學位級別：博士專業(yè)：軍事預防醫(yī)學指導教師：程天民20040501第三軍醫(yī)大學博士學位論文8組表達在保留重組蛋白TF結合活性破壞促凝血活性的基礎上將其與Genistein交聯(lián)構建一種新的復合物嘗試從抑制TF的促凝活性及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導雙方面入手并利用靶向蛋白提高Genistein局部藥物濃度充分發(fā)揮其多重抑瘤效果抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞生長轉(zhuǎn)移本研究內(nèi)容

2、主要分三個部分rmFpPIC9K酵母表達載體的構建通過RTPCR方法從小鼠肝臟組織獲得mFcDNA全長并對其進行定點突變測序正確后再用常規(guī)PCR方法擴增出所需目的片段NotEcoR雙酶切pPIC9K質(zhì)粒及目的片段后分別鋪膠回收連接過夜所構建載體均轉(zhuǎn)化大腸桿菌快速抽提陽性質(zhì)粒DNA酶切及測序鑒定rmF蛋白的畢赤酵母表達純化及活性初步鑒定構建載體以電穿孔法轉(zhuǎn)染酵母菌GS115在山梨醇選擇平板(HIS)上挑取陽性克隆依次進行PCR鑒定G418

3、篩選Mut篩選及小量搖瓶培養(yǎng)實驗尋找高拷貝菌株與表達蛋白的最佳收獲時段篩選結束后大量搖菌于最佳時段收獲上清液經(jīng)超濾濃縮透析脫鹽親和層析純化后將所收集樣品冷凍抽干備用純化蛋白用SDSPAGEWesternBlot鑒定并用凝血實驗和免疫組化法檢測其生理活性rmF與Genistein的交聯(lián)及交聯(lián)產(chǎn)物抗癌活性研究將rmF與Genistein用紫外交聯(lián)純化后取小鼠黑色素瘤細胞B16人乳腺癌細胞MCF7通過MTT比色法分析交聯(lián)產(chǎn)物對細胞增殖的影響制

4、作裸鼠皮下移植瘤和實驗性肺轉(zhuǎn)移模型研究交聯(lián)產(chǎn)物對腫瘤生長新生血管形成以及血行轉(zhuǎn)移的影響獲得以下主要結果1.從小鼠肝臟成功擴增出mFcDNA開放閱讀框架全長序列測序結果與Genbank資料(編號AK089402)對應序列完全相同并對上述序列進行3個氨基酸的定點突變(P10QK32EK341A)測序證實與設計位點完全一致2.從mF正常及突變?nèi)L序列PCR擴增出3個目的片段酶切連接后構建了3種rmFpPIC9K酵母表達載體(M1mF輕鏈pPI