PEI-pDCN納米復(fù)合物治療大鼠Thy-1腎炎實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腎小球硬化是各種腎小球疾病進(jìn)展的共同結(jié)局，其重要物質(zhì)基礎(chǔ)是腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量沉積。研究表明:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可以促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞(MC)合成ECM，影響基質(zhì)降解酶及其抑制劑的合成、分泌及整合素的表達(dá)，是腎小球硬化的重要影響因子。飾膠蛋白聚糖(decorin，DCN)是一種富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖，在ECM合成、組成和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。研究證實(shí):

2、DCN可以中和TGF-β1的活性，被認(rèn)為是TGF-β1的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn):DCN的過表達(dá)不僅抑制MC系膜細(xì)胞TGF-β1和ColⅣ的表達(dá)，而且參與調(diào)控MC的生長(zhǎng)和凋亡。因此DCN是一個(gè)很有應(yīng)用前景的防治腎小球疾病的細(xì)胞因子。
　　基因治療作為一種有潛力的疾病治療手段，越來越多的被研究工作者所關(guān)注。聚乙烯亞胺是(PEI)一種陽(yáng)離子有機(jī)聚合物，為研究應(yīng)用最廣的非病毒基因載體之一。PEI是一種高水溶性有機(jī)聚合物，它每

3、隔2個(gè)碳原子就有一個(gè)氮原子，在生理?xiàng)l件下，大約20％的氮原子發(fā)生質(zhì)子化，因此表面帶有大量正電荷，可以通過靜電作用和帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA(pDNA)結(jié)合，并且能壓縮、包裹質(zhì)粒形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物。PEI作為基因載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，較低的毒性，無免疫原性，易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成功的被運(yùn)用到體內(nèi)體外的許多實(shí)驗(yàn)。
　　本課題利用靜電作用合成PEI/pDCN納米復(fù)合物，體外轉(zhuǎn)染MC，經(jīng)G418篩選，挑選出穩(wěn)定高表達(dá)DCN蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆，并

4、利用MC回輸腎臟后可定居于腎小球系膜區(qū)的特性，把穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆經(jīng)左腎動(dòng)脈回輸?shù)酱笫骉hy-1腎炎動(dòng)物模型腎內(nèi)，觀察分泌的DCN對(duì)腎小球MC增生和ECM沉積的抑制作用。同時(shí)，細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了DCN的過表達(dá)對(duì)TGF-β1和ColⅣ的拮抗作用，和對(duì)MC生長(zhǎng)的調(diào)控。通過本課題的研究，為腎小球疾病的納米基因治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分 PEI/pDCN納米復(fù)合物的合成、轉(zhuǎn)染及對(duì)大鼠腎MC生長(zhǎng)的影響
　　目的合成PEI/pDCN納米

5、復(fù)合物，體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC并探討DCN過表達(dá)對(duì)大鼠MC的影響。
　　方法混合帶正電荷的PEI和帶負(fù)電荷的質(zhì)粒，通過自發(fā)的靜電作用可以形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物子;由于不同的N/P比值會(huì)影響到納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率，所以先以EGFP質(zhì)粒為報(bào)告基因，體外轉(zhuǎn)染MC，選出最佳的N/P比值，以此比值再合成PEI/pDCN納米復(fù)合物，轉(zhuǎn)染MC，用G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，用Western blot方法檢測(cè)，選出DCN高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克隆，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

6、及后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn);用Western blot方法，檢測(cè)DCN過表達(dá)對(duì)系膜細(xì)胞Ⅳ型膠原和TGF-β1的蛋白表達(dá);應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　結(jié)果用NicompTM380粒徑分析儀測(cè)定合成的PEI/pDCN納米復(fù)合物粒徑在146±70.91nm到151.7±72.43nm之間;不同的N∶P比例合成的PEI/pEGFP納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染MC，在N/P比值為20∶1的條件下轉(zhuǎn)染效率最高，和商品化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率相近;以此比例合

7、成PEI/pDCN納米復(fù)合物，轉(zhuǎn)染MC，經(jīng)G418篩選、Western blot鑒定，選出穩(wěn)定表達(dá)DCN的穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆D6;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1A-DCN質(zhì)?？缮险{(diào)MC內(nèi)DCN蛋白表達(dá)，降低ColⅣ和TGF-β1的蛋白表達(dá)水平，并且使G0/G1期的細(xì)胞數(shù)明顯增多，S期的細(xì)胞數(shù)減少，提示MC生長(zhǎng)受到抑制。
　　小結(jié)通過自發(fā)的靜電作用PEI和質(zhì)粒DNA合成納米復(fù)合物，可以在體外轉(zhuǎn)染MC，并且能獲得穩(wěn)定高表達(dá)DCN基因的MC株(D6)。

8、DCN參與調(diào)控MC的生長(zhǎng)，且可有效調(diào)節(jié)MC內(nèi)TGF-β1和ColⅣ的蛋白表達(dá)。
　　第二部分腎動(dòng)脈回輸PEI/pDCN納米復(fù)合物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MC對(duì)大鼠Thy-1腎炎的治療作用
　　目的明確回輸穩(wěn)定表達(dá)DCN的MC對(duì)大鼠Thy-1腎炎的治療作用
　　方法提取大鼠胸腺細(xì)胞免疫兔子制備ATS，免疫熒光法檢測(cè)其效價(jià);通過SD大鼠的尾靜脈注射復(fù)制大鼠Thy-1腎炎模型;建立PEI/pEGFP納米復(fù)合物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MC，然后通過左腎動(dòng)脈

9、回輸穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，進(jìn)而明確回輸細(xì)胞在大鼠腎臟內(nèi)的定位;經(jīng)左腎動(dòng)脈回輸穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞克隆D6到Thy-1腎炎模型鼠的左側(cè)腎臟，然后用免疫組化檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，明確回輸?shù)腄6對(duì)腎小球疾病的影響。
　　結(jié)果成功制備大鼠ATS抗血清，并成功復(fù)制大鼠Thy-1腎炎模型?；剌敿?xì)胞在腎小球中的定位:左腎約65±2.13％腎小球成陽(yáng)性表達(dá)，回輸細(xì)胞主要定位于腎小球毛細(xì)血管和腎系膜區(qū)。回輸D6穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞能在腎小球內(nèi)表達(dá)DCN蛋白，在回輸?shù)?天，DCN的蛋白表達(dá)量最