stTRAIl-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:
　　利用化學還原法制備了聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體并研究其理化性質、表征參數及細胞毒性、轉染效率。通過靜電吸附作用將納米金基因載體與含stTRAIL目的基因片段的重組質粒DNA按一定質量比結合構建了stTRAIL-納米金復合物，并應用該復合物聯合熱休克處理肝癌細胞，觀察其對熱休克肝癌細胞的增殖活性、細胞凋亡等的影響，并探討stTRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的相關機制。
　　方法:
　　1.利

2、用化學還原法制備聚乙烯亞胺修飾的納米金基因載體，用紫外分光光度計檢測納米金顆粒的吸收光譜及最大吸收峰處波長，在透射電鏡下觀察納米金顆粒的表觀形貌特征，用激光粒度儀檢測納米金顆粒的粒徑大小及其分布，用表面電位儀檢測納米金顆粒的表面電位（Zeta電位），用1％的瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測納米金基因載體與質粒DNA的結合穩(wěn)定性，CCK-8試劑盒檢測聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體及DNA-納米金復合物對HEK293細胞的細胞毒性作用，通過熒光顯微鏡觀

3、察聚乙烯亞胺納米基因載體介導pAcGFP-N1在體外培養(yǎng)的HEK293細胞中的表達，并分析其轉染效率。
　　2.將納米金基因載體與含stTRAIL目的基因片段的重組質粒DNA按不同質量比混合，1％瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測stTRAIL-納米金復合物結合的穩(wěn)定性，CCK-8試劑盒檢測其對SMMC7721細胞的細胞毒性，確定納米金與重組質粒DNA結合的最佳質量比。stTRAIL-納米金復合物聯合熱休克處理肝癌細胞后，用CCK-8試劑盒檢

4、測其對肝癌細胞SMMC7721的增殖活性的影響，并用流式細胞術檢測該復合物聯合熱休克處理肝癌細胞后促進肝癌細胞凋亡的作用。
　　3.Real-time PCR和Western blot分別檢測TRAIL信號通路下游Caspase-8、Caspase-3的mRNA、蛋白質水平的表達差異，探討stTRAIL-納米金復合物促進熱休克肝癌細胞凋亡的相關機制。
　　結果:
　　1.聚乙烯亞胺還原氯金酸可以得到表面帶正電荷的納米金

5、顆粒，呈單分散球形分布，其粒徑為12.3±3.3 nm。在PH=7.2時，Zeta電位為+（29.7±5.1）mV。1％瓊脂糖凝膠電泳實驗結果表明，當納米金/質粒DNA≥0.5時，質粒DNA可完全結合到納米金表面。體外轉染實驗表明，聚乙烯亞胺修飾納米金基因載體能介導pAcGFP-N1轉染HEK293細胞并在細胞中表達綠色熒光蛋白，其轉染效率可達25％。
　　2.瓊脂糖凝膠電泳實驗表明，當納米金/質粒DNA≥0.5時，重組質粒DNA

6、可完全結合到納米金顆粒表面。CCK-8試驗表明，納米金與重組質粒DNA按質量比5∶1結合時形成的復合物相對穩(wěn)定，且對細胞毒性較弱，最適合轉染stTRAIL基因。用按此比例結合的stTRAIL-納米金復合物聯合熱休克處理肝癌細胞，能明顯抑制肝癌細胞增殖活性，顯著地促進肝癌細胞凋亡。
　　3.Real-time PCR結果表明，經過stTRAIL-納米金復合物聯合熱休克處理的肝癌細胞組，TRAIL信號通路下游Caspase-8、Cas

7、pase-3的mRNA表達明顯增高。Westernblot結果同樣表明，實驗組TRAIL信號信號通路下游Caspase-8、Caspase-3等蛋白質表達明顯上調。
　　結論:
　　通過化學合成的納米金基因載體具備制備簡便、成本低、轉染效率較高的特點。
　　2.stTRAIL-納米金復合物按質量比5∶1結合較穩(wěn)定，能夠轉染stTRAIL基因。該復合物能夠在熱休克條件下能夠顯著地抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡。