金納米與磁納米顆粒及其復(fù)合物的生物傳感和細(xì)胞成像研究.pdf

1、貴金屬納米顆粒具有獨(dú)特的表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，SPR)吸收和散射性質(zhì)，已被廣泛用于生物傳感、細(xì)胞成像及癌癥治療等生物化學(xué)領(lǐng)域。而磁納米顆粒(MNPs)，尤其是超順磁性四氧化三鐵(Fe3O4)納米顆粒，也在磁分離、磁馳豫開關(guān)、磁治療以及核磁共振成像（MRI）等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了人們廣泛關(guān)注。近年來，復(fù)合納米材料，特別是核殼結(jié)構(gòu)的納米材料，由于其能克服單一材料存在的穩(wěn)定性差、修飾較難、功能單一等缺

2、陷，還能復(fù)合各種材料的性能，因而具有獨(dú)特的優(yōu)良性質(zhì)。其中，金納米包覆磁性納米復(fù)合顆粒(Fe3O4@Au)合成簡單、易修飾，且具有SPR和磁性雙重性質(zhì)，體現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力，已經(jīng)逐漸成為人們研究的焦點(diǎn)。然而，這些納米材料的應(yīng)用仍存在一些問題，例如生物分子如何有效調(diào)控金屬納米顆粒SPR性質(zhì)，使其能更好的應(yīng)用于生物傳感以及疾病診斷和治療？納米材料在細(xì)胞膜表面是否具有防御病毒功能？多功能納米材料已有很多報(bào)道，但很少能集靶向、多模式成像及多治療手

3、段于一身。基于此，針對(duì)上述存在的問題，本文以金納米顆粒(AuNPs)、MNPs、以及Fe3O4@Au復(fù)合納米顆粒為代表，拓寬了其在生物傳感的應(yīng)用，分析了生物分子如何有效調(diào)控金屬納米顆粒等離子共振性質(zhì)，以進(jìn)一步用于癌細(xì)胞成像與治療，并考察了納米材料修飾的細(xì)胞膜是否具有防御病毒功能。具體的研究內(nèi)容包括以下兩部分:
　　第一部分:基于AuNPs與MNPs在生物傳感中的應(yīng)用。利用AuNPs的SPR吸收性質(zhì)，以正電AuNPs為探針實(shí)現(xiàn)了可視

4、化檢測三磷酸腺苷(ATP)與堿性磷酸酶(ALP);將核酸適配體(aptamer)的高選擇性與MNPs磁性分離的性質(zhì)結(jié)合，利用銀納米顆粒(AgNPs)的SPR散射性質(zhì)，建立了高靈敏、高選擇性地測定溶菌酶(lysozyme)的方法?？疾炝松锓肿尤绾斡行д{(diào)控貴金屬納米顆粒SPR性質(zhì)。具體工作如下:
　　1.ATP誘導(dǎo)正電AuNPs聚集的光學(xué)性質(zhì)研究及定量檢測ATP。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)ATP濃度，可以有效調(diào)控AuNPs在可見區(qū)的SPR吸

5、收性質(zhì)。提出了ATP與AuNPs的作用主要通過兩種方式:首先是ATP的磷酸根與AuNPs表面陽離子表面活性劑之間的靜電作用，其次是金原子與ATP含N堿基之間的配位作用?；贏uNPs的SPR吸收用于定量檢測ATP，方法簡單、成本較低、耗時(shí)較短、選擇性好，檢測限達(dá)到0.82μM。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATP的類似物包括GTP,UTP，CTP，ADP，AMP等，誘導(dǎo)AuNPs聚集程度各不相同，由此可建立了一種簡單的可視化分析方法區(qū)分ATP類似物。

6、
　　2.ALP經(jīng)過脫磷酸化反應(yīng)使ATP轉(zhuǎn)化為腺苷，建立了一種基于AuNPs的免標(biāo)記可視化方法檢測ALP。該方法的檢測范圍可以通過加入金屬離子動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，加入Ca2+或Pb2+可以使其線性范圍從100-600unit/L分別調(diào)節(jié)至5.0-100unit/L及0.2-20unit/L，靈敏度得到極大提高。該方法具有高選擇性、高靈敏度、檢測范圍動(dòng)態(tài)可調(diào)的優(yōu)點(diǎn)，用于檢測人血清樣品中ALP含量，與臨床結(jié)果一致。
　　3.Aptamer

7、偶聯(lián)MNPs用于lysozyme的富集與高靈敏分析檢測。建立了一種基于MNPs與aptamer作為高選擇性的分離富集載體，AgNPs作為散射信號(hào)探針的方法用于檢測lysozyme。首先利用MNPs與aptamer偶聯(lián)復(fù)合物特異性分離并富集lysozyme，再根據(jù)其正電荷性質(zhì)，可與檸檬酸根包被的AgNPs通過靜電作用結(jié)合，磁性分離上清液中AgNPs強(qiáng)烈的表面等離子共振散射光降低，可用于定量分析lysozyme。磁性分離下層吸附的AgNPs

8、具有強(qiáng)烈的暗場散射光，可用暗場散射成像對(duì)lysozyme進(jìn)行半定量分析。方法結(jié)合了aptamer的高選擇性以及l(fā)ysozyme帶正電荷的兩個(gè)性質(zhì)，為測定lysozyme設(shè)下雙重開關(guān)，能提高方法的選擇性及測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。以具有強(qiáng)散射信號(hào)的AgNPs作為信號(hào)探針，可以提高方法靈敏度，檢測限可低至0.1nM。該方法設(shè)計(jì)具有普遍適用性，對(duì)于復(fù)雜樣品的測定具有重要意義。
　　第二部分:MNPs與Fe3O4@Au復(fù)合納米顆粒在細(xì)胞成像中的應(yīng)

9、用。首先，以MNPs為例，考察了在細(xì)胞膜表面構(gòu)建“鐵籠子”是否具有防御病毒入侵的功能，拓寬了磁納米材料在細(xì)胞成像及生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。其次，我們結(jié)合了Au與Fe3O4各自優(yōu)越的性能，制備成復(fù)合納米顆粒，修飾靶向配體，構(gòu)建了Fe3O4@Au多功能納米材料用于癌細(xì)胞的靶向多模式成像與治療。具體工作如下:
　　1.細(xì)胞膜表面構(gòu)建“鐵籠子”用于抗病毒入侵。本文使用人喉癌上皮細(xì)胞(HEp-2)，探討了細(xì)胞膜外形成網(wǎng)狀“鐵籠子”是否能抑制呼吸

10、道合胞病毒(RSV)的感染。MNPs可通過鏈霉親和素與生物素的特異性反應(yīng)吸附到細(xì)胞膜表面，利用顆粒表面修飾DNA的多價(jià)效應(yīng)，通過雜交形成網(wǎng)狀“鐵籠子”，期望達(dá)到抑制病毒入侵的效果。實(shí)驗(yàn)采用掃描電鏡(SEM)證實(shí)了“鐵籠子”在細(xì)胞膜表面形成。其具有良好的生物相容性，能在一定程度上防御病毒侵染細(xì)胞。當(dāng)病毒侵染MOI值為2時(shí)，有“鐵籠子”保護(hù)的細(xì)胞，其細(xì)胞存活率能從24.1±4.4％提高到49.0±10.0％。利用免疫熒光顯微技術(shù)，表明“鐵籠

11、子”抑制病毒入侵可能通過以下兩種方式:其空間位阻效應(yīng)阻礙了病毒與細(xì)胞膜的結(jié)合;降低細(xì)胞膜柔韌性，抑制病毒出胞以及在細(xì)胞間的擴(kuò)散。本文利用納米材料在一定程度上實(shí)現(xiàn)抗病毒入侵，為開發(fā)新的抗病毒藥物以及其它防治病毒性疾病的新方法研究提供了思路。
　　2.多功能Fe3O4@Au核殼納米花靶向癌細(xì)胞雙模式成像與治療。發(fā)展能結(jié)合診斷與治療于一身的多功能納米材料在分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有極其重要的意義。本文將五個(gè)獨(dú)特的功能有機(jī)地整合到了一個(gè)粒徑為70nm

12、的Fe3O4@Au納米花上。Fe3O4核可作為MRI顯影劑;表面包被金殼，使其具有近紅外吸收，產(chǎn)生光熱效應(yīng)使細(xì)胞溫度升高，可用于光熱治療。高溫能促進(jìn)負(fù)載的抗癌藥物鹽酸阿霉素(Dox)快速釋放，產(chǎn)生紅色熒光，可通過共聚焦熒光顯微鏡監(jiān)測其釋放過程。顆粒表面偶聯(lián)aptamer可提高藥物的靶向釋放。該Fe3O4@Au多功能納米材料結(jié)合了熒光成像與MRI雙模式成像方式，可提高癌細(xì)胞診斷準(zhǔn)確性，并有利于監(jiān)測藥物釋放。當(dāng)納米材料負(fù)載0.8μMDox時(shí)

13、達(dá)到的治療效果，可與單獨(dú)使用2.0μMDox時(shí)相當(dāng)。因此，將化療與光熱治療結(jié)合使用，可以減少藥物用量，降低非特異性的毒副作用?？傊摱喙δ芗{米材料同時(shí)具有靶向、雙模式成像與雙治療手段結(jié)合的功能，對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是癌癥治療具有潛在的意義。
　　總之，本論文具有以下三個(gè)創(chuàng)新點(diǎn):（一）利用生物分子實(shí)現(xiàn)了對(duì)金屬納米顆粒SPR性質(zhì)的有效調(diào)節(jié)。（二）構(gòu)建了與傳統(tǒng)的小分子設(shè)計(jì)不同的病毒防御系統(tǒng)，以磁納米顆粒在細(xì)胞膜表面形成“鐵籠子”抗病毒