人食管癌細(xì)胞熱休克蛋白70肽復(fù)合物的提取及其抗瘤活性的研究.pdf

1、研究背景 食管癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之～，對(duì)食管癌治療的研究除了手術(shù)、放療和化療外，最引人注目的是食管癌腫瘤疫苗的研究。腫瘤疫苗輸注病人體內(nèi)后通過(guò)激活腫瘤患者自身的免疫系統(tǒng)，引起特異性的抗腫瘤反應(yīng)，對(duì)腫瘤起特異性殺傷作用，達(dá)到治愈腫瘤的目的，因而具有高度特異性。 熱休克蛋白70是體內(nèi)廣泛表達(dá)的一種保守蛋白，是熱休克蛋白的一種，在熱休克等應(yīng)激狀態(tài)下表達(dá)增加。研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，在食管癌的研究中也

2、發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70與食管癌的腫瘤浸潤(rùn)程度、腫瘤病理類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)，從腫瘤組織或細(xì)胞提取的熱休克蛋白具有保護(hù)機(jī)體抵御同種腫瘤再次攻擊的能力，熱休克蛋白腫瘤疫苗成為了一種新的腫瘤疫苗。已有研究表明在肝癌、肺癌、胃癌和黑色素瘤等腫瘤中提取的熱休克蛋白70肽復(fù)合物具有在體內(nèi)外產(chǎn)生抗腫瘤作用的活性，而在食管癌中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 在對(duì)熱休克蛋白腫瘤疫苗的研究中存在多種腫瘤疫苗形式，其中將熱休克蛋白肽復(fù)合物與DC聯(lián)合或者

3、將熱休克蛋白肽復(fù)合物與腫瘤抗原相結(jié)合的疫苗形式為常見(jiàn)的疫苗方式，但對(duì)于不同腫瘤，腫瘤疫苗的不同應(yīng)用形式效果不同。在研究腫瘤疫苗的抗腫瘤作用中，找到最佳的腫瘤疫苗形式，也是決定腫瘤疫苗能否發(fā)揮最大作用的關(guān)鍵問(wèn)題。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?從食管癌細(xì)胞株EC-109中分離提取熱休克蛋白70肽復(fù)合物，研究熱休克蛋白70肽復(fù)合物的抗腫瘤活性及特異性；將熱休克蛋白70肽復(fù)合物聯(lián)合DC或MHC-I類(lèi)抗原肽，研究不同形式熱休克蛋白70腫瘤疫苗的抗腫

4、瘤作用；研究熱休克蛋白70肽復(fù)合物對(duì)DC和T淋巴細(xì)胞的作用，對(duì)其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討，為HSP70肽復(fù)合物作為食管癌腫瘤疫苗的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 1. 食管癌細(xì)胞HSP70-PCs的提純： 體外培養(yǎng)食管癌EC-109細(xì)胞，42~C制造細(xì)胞熱休克，收集109細(xì)胞，裂解，超聲破碎細(xì)胞；制備CNBr-Sepharose4B親和層析柱，將細(xì)胞裂解上清加入層析柱，經(jīng)親和層析分離純化蛋白； 2. HSP7

5、0-PCs的定性、定量檢驗(yàn)： 利用SDS-PAGE凝膠電泳、銀染、Westernblot進(jìn)行定性及純度檢驗(yàn)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度； 3. HSP70-PCs抗腫瘤活性的研究： 將HSP70-PCs加入T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)CTL產(chǎn)生，將共孵育3天的T細(xì)胞按40：1加入預(yù)先接種了腫瘤細(xì)胞的孔板中，分別作用于食管癌細(xì)胞(EC．109)、胃癌細(xì)胞(BGC-823)和肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)，采用MTT法檢測(cè)H

6、SP70-PCs的抗腫瘤作用和抗腫瘤特異性； 4. 不同HSP70-PCs腫瘤疫苗的抗腫瘤效果： 體外分離人外周血單核細(xì)胞，分離培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)和T淋巴細(xì)胞，體外培養(yǎng)的DCs，負(fù)載HSP70-PCs，與T細(xì)胞共孵育，誘導(dǎo)CTL，檢測(cè)對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；從食管癌細(xì)胞膜上分離MHC-I類(lèi)抗原肽，經(jīng)與HSP70-PCs混合后，誘導(dǎo)CTL，檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用； 5. HSP70-PCs對(duì)免疫細(xì)胞的作用

7、： 將HSP70-PCs、MHC-I類(lèi)抗原肽分別負(fù)載DCs組，與T細(xì)胞共孵育，7天后取培養(yǎng)液上清，檢測(cè)培養(yǎng)液上清中細(xì)胞因子的溶解殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；MTT法檢測(cè)共孵育7天的T淋巴細(xì)胞的增殖程度： 6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 實(shí)驗(yàn)中各組至少設(shè)三個(gè)復(fù)孔，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示，兩組間比較利用Student-t檢驗(yàn)，多個(gè)組間比較用方差分析(AVONA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α：0．05。 結(jié)果 1．細(xì)胞經(jīng)熱休克

8、作用后，形態(tài)學(xué)上有明顯變化；經(jīng)親和層析柱過(guò)柱、洗脫后得到的蛋白經(jīng)電泳鑒定為單一的蛋白； 2．HSP70-PCs誘導(dǎo)的CTL對(duì)食管癌細(xì)胞具的殺傷率為(37．79士7．54)％，對(duì)胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的殺傷率分別為(19．52+3．70)％和(9．92+1．60)％，對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷率明顯高于對(duì)胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的殺傷率(P<0．05)； 3．負(fù)載HSP70-PCs的DCs誘導(dǎo)的CTL對(duì)食管癌細(xì)胞是殺傷率為(58．36±3．

9、17)％，對(duì)胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的殺傷率分別為(29．85+2．97)％和(17．54+2．55)％，對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷率明顯高于對(duì)胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的殺傷率(／><0．05)；HSP70-PCs與MHC-I類(lèi)分子相關(guān)肽混合物誘導(dǎo)的CTL對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷率為(43．68~7．80)％，對(duì)胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的殺傷率分別為(27．47+2．99)％和(9．52+0．79)％，對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷率明顯高于對(duì)胃癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的殺傷率(P<0．

10、05)；負(fù)載HSP70-PCs的DCs誘導(dǎo)的CTL對(duì)食管癌細(xì)胞是殺傷率明顯高于HSP70-PCs誘導(dǎo)的CTL和HSP70-PCs與MHC-I類(lèi)分子相關(guān)肽混合物誘導(dǎo)的CTL對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷率(P<0．05)； 4．HSP70-PCs負(fù)載DCs后與T細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液對(duì)食管癌細(xì)胞的溶解殺傷率為(10．114-1．30)％，對(duì)照組上清液對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷率為(1．77+0．31)％，兩者比較有明顯差異(P<0．05)； 5．

11、HSP70-PCs負(fù)載DCs組對(duì)T淋巴細(xì)胞的刺激增殖指數(shù)在DC：T=I：40時(shí)為SI=I．95±O．18，在時(shí)，刺激增殖指數(shù)分別為1．40±0.13和1．28士O．19，均明顯高于對(duì)照組(P<0．05)；且在1：40時(shí)刺激增殖能力高于1：20和1：100兩組(P<0．05)。 結(jié)論 1．利用親和層析法從熱休克處理過(guò)的食管癌細(xì)胞株上分離出的HSP70-PCs具有特異性的抗腫瘤作用； 2．HSP70-PCs聯(lián)合DC能