2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1.構(gòu)建IQGAP1基因過表達(dá)和基因干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及其對照細(xì)胞系。
  2.通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)分別檢測IQGAP1基因?qū)ρ苌傻挠绊憽?br>  3.研究IQGAP1對血管生成影響的分子機(jī)制。
  方法:
  1.利用Lipofectamine2000將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)標(biāo)記的IQGAP1過表達(dá)質(zhì)粒和它所對應(yīng)的對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到人食管癌細(xì)胞EC

2、9706,用G418耐藥單克隆細(xì)胞的篩選方法,等到穩(wěn)定生長后,熒光顯微鏡下觀察其細(xì)胞定位,并通過Western blot檢測GFP-IQGAP1融合蛋白的表達(dá),確定IQGAP1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。
  2.利用Lipofectamine2000將IQGAP1干擾質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)人食管癌細(xì)胞KYSE150內(nèi),采用G418篩選耐藥克隆,待其穩(wěn)定生長后,熒光顯微鏡下觀察KYSE150細(xì)胞GFP的表達(dá),并通過Wester

3、n blot檢測對照組與干擾組IQGAP1蛋白的表達(dá)情況,確定IQGAP1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。
  3.分別通過體外 HUVECs小管形成實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)來檢測IQGAP1基因表達(dá)對腫瘤血管生成的影響。
  4.采用 Western blot技術(shù)研究 IQGAP1對食管癌細(xì)胞中 VEGFA與其受體VEGFR2、p-VEGFR2血管生成相關(guān)因子表達(dá)的影響。
  5.通過Western blot技術(shù)研究

4、IQGAP1對Akt和ERK活化的影響。
  6.在IQGAP1過表達(dá)組細(xì)胞中加入Akt和ERK抑制劑進(jìn)行干預(yù)處理后,觀察抑制劑對VEGFA和p-VEGFR2蛋白表達(dá)的影響及對血管生成的影響。
  結(jié)果:
  1.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染含GFP-IQGAP1重組質(zhì)粒的EC9706細(xì)胞中觀察到其為胞質(zhì)定位; Western blot結(jié)果顯示,在IQGAP1過表達(dá)細(xì)胞中有GFP-IQGAP1融合蛋白的表達(dá),而在其對照

5、組內(nèi)則沒有,說明IQGAP1過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系已構(gòu)建成功。
  2.在熒光顯微鏡下可觀察到, GFP在轉(zhuǎn)染IQGAP1干擾質(zhì)粒及對照質(zhì)粒的KYSE150細(xì)胞中為全細(xì)胞定位;對支架蛋白IQGAP1在干擾組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量與其在對照組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量通過Western blot進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。
  3.體外HUVECs小管形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比較,IQGAP1過表達(dá)組小管生

6、成數(shù)更多,而且所生成小管的管腔結(jié)構(gòu)更加完整,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),表明IQGAP1過表達(dá)在體外可以促進(jìn)血管的生成;體內(nèi)雞胚尿囊膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,IQGAP1過表達(dá)組生成的血管數(shù)量較對照組多,并且所生成血管的形態(tài)舒展,顏色較為鮮紅,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),說明IQGAP1過表達(dá)可以促進(jìn)體內(nèi)血管的生成;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明IQGAP1過表達(dá)后會促進(jìn)腫瘤血管的生成。
  4. IQGA

7、P1干擾組采用體外HUVECs小管生成實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,與對照組相比較,發(fā)現(xiàn)IQGAP1基因干擾后小管生成數(shù)較少,生成小管的管腔結(jié)構(gòu)也不完整,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),表明IQGAP1干擾后在體外可以抑制血管的生成;體內(nèi)雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IQGAP1基因干擾后所生成的血管數(shù)量較對照組少,生成的血管色澤灰暗并且主血管較少,經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)得,兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明干擾IQGAP

8、1基因表達(dá)后能夠明顯抑制腫瘤的血管生成。
  5.在IQGAP1過表達(dá)的細(xì)胞中,經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn),VEGFA與p-VEGFR2蛋白表達(dá)量與其在對照細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量相比都升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),而VEGFR2蛋白的表達(dá)量則在IQGAP1過表達(dá)組與其對照組細(xì)胞中無明顯差異,表明IQGAP1可能通過VEGFA與VEGFR2相互作用后促進(jìn)VEGFR2發(fā)生磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)血管的生成。
  6.在IQ

9、GAP1干擾組細(xì)胞中,經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn),VEGFA與p-VEGFR2蛋白的表達(dá)量與其在對照細(xì)胞內(nèi)相比,表達(dá)量都降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的意義(P<0.0001),而VEGFR2的表達(dá)量則在IQGAP1干擾組與其對照組中無明顯差異,表明IQGAP1可能通過阻斷了VEGFA與其受體VEGFR2的相互作用進(jìn)而抑制血管生成的過程。
  7.經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn),IQGAP1過表達(dá)組細(xì)胞中p-Akt、 p-ER

10、K蛋白的表達(dá)量與其在對照組的結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)兩者的表達(dá)量都升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P<0.0001);而IQGAP1干擾組細(xì)胞p-Akt、 p-ERK的表達(dá)量均低于其在對照組內(nèi)的表達(dá)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001);說明IQGAP1對腫瘤細(xì)胞血管生成的發(fā)生機(jī)制的調(diào)控可能通過活化Akt和ERK信號通路發(fā)揮作用的。
  8.在 IQGAP1過表達(dá)組細(xì)胞中加入Akt和 ERK抑制劑干預(yù)后, VEGFA和p-VEGFR2蛋白的表達(dá)

11、量顯著降低,并且經(jīng)抑制劑干預(yù)后血管生成數(shù)也降低,說明IQGAP1可能通過AKT或ERK/VEGFA-VEGFR2信號通路來影響腫瘤血管生成。
  結(jié)論:
  1.成功構(gòu)建了IQGAP1過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及IQGAP1干擾的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
  2. IQGAP1過表達(dá)可以促進(jìn)體內(nèi)外腫瘤的血管生成,而干擾IQGAP1表達(dá)后則會有效的抑制腫瘤血管的生成。
  3. IQGAP1對食管癌中血管生成的作用機(jī)制可能與VEGFA與

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