Bufalin對(duì)人食管癌細(xì)胞4EBP1活化及凋亡的影響.pdf

1、食管癌是一種常見的惡性腫瘤。我國平均每年發(fā)病人數(shù)約250，000人，約占全世界年均發(fā)病人數(shù)的50％以上。目前普遍認(rèn)可的是，食管癌的發(fā)生是多因素、多基因、多階段的復(fù)雜的發(fā)生發(fā)展過程。但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此，食管癌治療的主要研究方向依然是其發(fā)生發(fā)展過程中細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常活化和新型抗腫瘤藥物的靶點(diǎn)。
　　多個(gè)研究報(bào)道證明:mTOR/4EBP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在異常的激活。mTOR通路被認(rèn)為是蛋白質(zhì)合成

2、的主要信號(hào)調(diào)節(jié)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等調(diào)節(jié)。mTOR是一種多功能激酶，參與許多重要細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)?；罨膍TOR使其下游的4EBP1發(fā)生磷酸化，磷酸化的4EBP1與eIF4E的親和力下降并與之解離，促進(jìn)翻譯起始復(fù)合物形成，從而加速蛋白質(zhì)合成。與之相反，當(dāng)mTOR被抑制時(shí)，使得4EBP1發(fā)生去磷酸化，并與eIF4E結(jié)合從而抑制翻譯過程起始并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染wtmTOR質(zhì)粒來研究食管癌細(xì)胞中4EBP1表達(dá)及活

3、化的改變，探討wtmTOR質(zhì)粒對(duì)人食管癌細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路的影響，并進(jìn)一步檢測Bufalin（蟾蜍靈）對(duì)mTOR/4EBP1通路及細(xì)胞凋亡的影響。從而揭示食管癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，并為食管癌的治療提供新的思路。
　　目的:探討B(tài)ufalin對(duì)人食管癌細(xì)胞4EBP1活化及凋亡的影響。
　　方法:
　　1將攜帶wtmTOR基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，并使用脂質(zhì)體法將攜帶wtmTOR基因的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到食管

4、癌Eca109細(xì)胞中，使用Western Blot方法分別檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0h、12h、24h、30h、36h、42h、48h后細(xì)胞內(nèi)4EBP1表達(dá)及其活化水平的變化，并得出轉(zhuǎn)染的最佳時(shí)間。
　　2用Western Blot方法分別檢測不同處理組（對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組、轉(zhuǎn)染后加雷帕霉素組）中細(xì)胞內(nèi)mTOR的表達(dá)，并檢測4EBP1表達(dá)及活化水平，進(jìn)而研究轉(zhuǎn)染wtmTOR質(zhì)粒后Bufali

5、n對(duì)食管癌mTOR通路的影響。
　　3用RT-PCR方法分別檢測不同處理組（對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組、轉(zhuǎn)染后加雷帕霉素組）中細(xì)胞內(nèi)mTOR分子水平的表達(dá)。并檢測不同處理組細(xì)胞內(nèi)4EBP1分子水平的表達(dá)。
　　4采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測不同處理組（對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組、wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組、轉(zhuǎn)染后加雷帕霉素組）細(xì)胞內(nèi)Bad和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。

6、r>　　結(jié)果:
　　1 RT-PCR結(jié)果顯示:成功將wtmTOR質(zhì)粒擴(kuò)增并轉(zhuǎn)染到食管癌細(xì)胞中，并檢測到Eca109細(xì)胞株內(nèi)mTOR的mRNA水平表達(dá)量在wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(1.274±0.006)明顯高于對(duì)照組（0.422±0.012）及空載體轉(zhuǎn)染組(0.450±0.025);而在轉(zhuǎn)染后加入Bufalin(0.304±0.026)及雷帕霉素（0.244±0.015）后又明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而4EBP1

7、的mRNA水平表達(dá)量在對(duì)照組（1.015±0.021）、空載體轉(zhuǎn)染組（1.004±0.016）、wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（1.085±0.017）、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組（1.077±0.024）、轉(zhuǎn)染后加雷帕霉素組(1.046±0.020)之間無明顯區(qū)別，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2成功將wtmTOR質(zhì)粒擴(kuò)增并轉(zhuǎn)染到食管癌細(xì)胞中，并檢測到其下游基因4EBP1表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染0h、12h、24h、30h、36h、4

8、2h、48h后無明顯變化（0.872±0.021,0.854±0.016,0.796±0.011,0.787±0.015,0.831±0.034,0.835±0.032，0.788±0.036，P＞0.05），差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而4EBP1的活化水平在wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后明顯升高，且隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間的增加(0h、12h、24h、30h)表達(dá)量逐漸升高(0.357±0.025，0.572±0.022，0.655±0.017，0.895±

9、0.021)，至30h（0.895±0.021）達(dá)到最高值，此后(36h、42h、48h)表達(dá)量開始下降（0.641±0.014，0.425±0.031，0.352±0.034，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3 Western Blot結(jié)果顯示:成功將wtmTOR質(zhì)粒擴(kuò)增并轉(zhuǎn)染到食管癌細(xì)胞中，并檢測到mTOR的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染組（0.967±0.015）明顯高于對(duì)照組（0.472±0.033）和空載體轉(zhuǎn)染組（0.495±

10、0.028）;而在轉(zhuǎn)染后加入Bufalin（0.398±0.031）及雷帕霉素（0.381±0.024）后表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4EBP1蛋白的表達(dá)水平在對(duì)照組（0.655±0.013）、空載體轉(zhuǎn)染組（0.642±0.026）、wtmTOR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（0.670±0.015）、轉(zhuǎn)染后加Bufalin組（0.674±0.023）、轉(zhuǎn)染后加雷帕霉素組（0.645±0.033）無明顯差別，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

11、P＞0.05)。4EBP1的活化水平在轉(zhuǎn)染組（0.825±0.016）明顯高于對(duì)照組（0.502±0.031）和空載體組（0.521±0.027）;而在轉(zhuǎn)染后加入Bufalin（0.376±0.015）及雷帕霉素（0.352±0.022）后活化水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果顯示:Bcl-2和Bad蛋白主要表達(dá)于食管癌細(xì)胞Eca109的細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，為棕黃色，在高倍鏡下觀察呈顆粒狀，結(jié)

12、果顯示轉(zhuǎn)染wtmTOR質(zhì)粒組Bad陽性表達(dá)率為16.53％，明顯低于對(duì)照組(35.67％)和空載體組(37.81％);而在轉(zhuǎn)染后加入Bufalin(64.22％)及雷帕霉素(65.30％)后又明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而轉(zhuǎn)染wtmTOR質(zhì)粒組Bcl-2陽性表達(dá)率為86.67％，明顯高于對(duì)照組(64.43％)和空載體組(62.75);而在轉(zhuǎn)染后加入Bufalin(37.26％)及雷帕霉素(36.07％)后又明顯下降，差