Bufalin對裸鼠食管鱗狀細(xì)胞癌原位移植瘤mTOR-4E-BP1信號通路及凋亡的影響.pdf

1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，目前排在我國惡性腫瘤的第四位，在我國惡性腫瘤中占22.4％，每年約有25萬新病人產(chǎn)生。食管癌的臨床治療雖有進(jìn)步，5年生存率仍然較低。因此，研究與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及藥物作用的靶點來尋求新的抗腫瘤藥物，成為食管癌治療研究的重點。
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及4E-BP1是磷脂酰肌醇3一激酶/蛋白激酶B(phosph

2、atidylinositol3-Kinase/proteinkinase B，P13K/PKB)信號通路的下游分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化中發(fā)揮重要作用。mTOR活化后，使4E-BP1磷酸化，eIF-4E被釋放并與其他翻譯起始因子形成復(fù)合物，從而解除對翻譯的抑制作用，導(dǎo)致翻譯起始，加速與生長分化相關(guān)的蛋白的表達(dá)。當(dāng)mTOR被抑制時，去磷酸化的4E-BP1與eIF4E結(jié)合，形成eIF4E-4EBP1復(fù)合體，抑制翻譯起始。研究表明，4E-BP

3、1的磷酸化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此該通路是目前研究的焦點，為臨床治療腫瘤提供新的靶點。
　　Bufalin（蟾蜍靈）是中藥蟾酥中提取的一種毒性配基，屬強心甙類物質(zhì)。這種成分具有抗癌、強心、抗炎、增強免疫等作用，臨床上已廣泛應(yīng)用于治療多種實體腫瘤、血液病和慢性乙肝等疾病。我們前期的體外實驗表明:Bufalin可有效抑制食管癌細(xì)胞的生長和增殖。本實驗旨在進(jìn)一步探討B(tài)ufalin在食管癌動物模型中的抗腫瘤作用，為臨床應(yīng)用于食管

4、癌的治療提供實驗依據(jù)。
　　目的:探討B(tài)ufalin對裸鼠食管癌原位移植瘤的抑制作用及其可能誘導(dǎo)凋亡的機制。
　　方法:
　　1將36只人食管癌細(xì)胞株ECA109建立的裸鼠原位移植瘤模型隨機分為模型組、Bufalin低劑量組（0.5kg/ml，BL）、中劑量組(1.0kg/ml，BM)、高劑量組(1.5kg/ml，BH)、雷帕霉素組(RAPA)、Bufalin高劑量組與雷帕霉素聯(lián)合組(BR)，每組6只，腹腔注射給藥持續(xù)

5、30天，用藥結(jié)束后全部處死36只裸鼠，完整取出腫瘤，測量裸鼠用藥前后的體重、腫瘤大小，計算腫瘤抑制率。
　　2腫瘤組織HE染色觀察腫瘤壞死程度。
　　3 RT-PCR法檢測各組mTOR、4E-BP1 mRNA的表達(dá)情況。
　　4 Western Blot及免疫組化法檢測各組mTOR、4E-BP1、Bad、Bcl-2的蛋白水平表達(dá)及4E-BP1的活化情況。
　　5流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組移植瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)。
　

6、　結(jié)果:
　　1模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組治療前體重為20.9±2.4g、20.8±1.5g、20.8±2.1g、20.9±2.7g、20.9±1.9g、20.8±2.1g，治療后的體重為27.9±3.0g、28.2±1.9g、27.9±2.9g、28.1±2.8g、27.9±2.0g、27.8±2.6g,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后各組移植瘤體積分別為1.791±0.087cm3、1.720±0.08

7、8cm3、1.137±0.060cm3、0.702±0.054cm3、0.699±0.079cm3、0.506±0.076cm3，實驗組腫瘤抑制率分別為4.0％、36.5％、60.8％、61.0％、71.7％，BM、BH、RAPA、BR組腫瘤體積與模型組比較縮小(P＜0.05)，BR組腫瘤體積與其余各組比較縮小，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2腫瘤組織HE染色顯示:各組移植瘤內(nèi)均可見壞死。模型組壞死少見;BL組以灶狀

8、壞死為主;BM組腫瘤組織內(nèi)可見大片狀壞死;BH、RAPA及BR組均可見大面積壞死，壞死組織內(nèi)可見散在癌細(xì)胞團(tuán)。
　　3 RT-PCR結(jié)果顯示:模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組移植瘤4E-BP1 mRNA表達(dá)水平分別為1.032±0.061、1.039±0.082、1.036±0.093、1.036±0.081、1.044±0.092、1.037±0.087各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組移植瘤mTOR m

9、RNA表達(dá)水平分別為1.136±0.083、1.124±0.044、0.994±0.142、0.823±0.113、0.787±0.074、0.661±0.070,BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較降低（P＜0.05），BR組表達(dá)水平與其余各組比較降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4 Western Blot結(jié)果顯示:模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組移植瘤mTOR蛋白表達(dá)水平分別為1.58±

10、0.121、1.52±0.110、1.03±0.141、0.81±0.150、0.79±0.110、0.61±0.171，BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較降低（P＜0.05），BR組表達(dá)水平與其余各組比較降低(P＜0.05)。各組移植瘤4E-BP1蛋白表達(dá)水平分別為1.205±0.143、1.320±0.131、1.310±0.142、1.217±0.133、1.315±0.134、1.214±0.121, BM、BH、

11、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較降低(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較降低(P＜0.05)。各組移植瘤4E-BP1磷酸化水平分別為1.662±0.110、1.513±0.095、1.082±0.150、0.767±0.070、0.732±0.071、0.627±0.063，BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較降低(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較降低（P＜0.05）。各組移植瘤Bad蛋白表達(dá)水平分

12、別為0.610±0.054、0.695±0.055、0.818±0.151、1.037±0.123、1.056±0.105、1.180±0.160,BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較升高(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較升高(P＜0.05)。各組移植瘤Bcl-2蛋白表達(dá)水平分別為1.630±0.070、1.520±0.092、1.052±0.07g、0.785±0.080、0.743±0.081、0.556±0

13、.058, BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較降低(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　腫瘤組織免疫組化反應(yīng)積分（染色強度與陽性百分比乘積）結(jié)果顯示:模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組移植瘤mTOR免疫反應(yīng)積分分別為10.5±0.4、8.8±0.4g、7.3±1.0、5.0±1.1、5.0±1.1、3.0±0.6,BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與

14、模型組比較減小(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較減小(P＜0.05)。各組移植瘤4E-BP1免疫反應(yīng)積分分別為7.7±1.4、8.3±1.2;7.8±1.0;7.3±1.0;8.2±1.2;7.3±1.0，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組移植瘤4E-BP1的免疫反應(yīng)積分分別為10.0±1.5、8.7±0.5、7.0±1.1、3.5±0.5、3.7±0.5、2.5±0.5,BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模

15、型組比較減小(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較減小(P＜0.05)。各組移植瘤Bad免疫反應(yīng)積分分別為2.2±0.4、2.7±0.5、4.2±1.0、7.8±1.0、8.2±1.2、10.5±1.6,BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較升高(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較升高（P＜0.05）。各組移植瘤Bcl-2免疫反應(yīng)積分分別為10.0±1.5、8.8±0.4、7.0±1.1、3.7±0.5、3.

16、7±0.5、2.7±0.5，BM、BH、RAPA、BR組表達(dá)水平與模型組比較減小(P＜0.05)，BR組表達(dá)水平與其余各組比較減小，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5 PI染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果:模型組、BL、BM、BH、RAPA及BR組移植瘤凋亡指數(shù)分別為2.58±0.16％、5.48±0.27％、11.05±1.12％、23.47±1.05％、22.29±1.20％、20.32±1.06％，實驗各組凋亡指

17、數(shù)均高于模型組(P＜0.05)，以BH組凋亡指數(shù)最高，BH組凋亡指數(shù)與其余各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1 Bufalin可有效抑制裸鼠人食管癌原位移植瘤的生長。
　　2 Bufalin可通過抑制mTOR/4E-BP1信號通路的活化來達(dá)到抑制腫瘤生長的效果，為Bufalin成為人食管鱗狀細(xì)胞癌的分子靶向治療藥物提供了一個重要的理論依據(jù)。
　　3 Bufalin作用后的凋亡促進(jìn)基因Ba