iNOS信號(hào)通路對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌治療的重要作用.pdf

1、肺癌目前仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康問(wèn)題，并且占全世界癌癥死亡原因的第一位，其中所有階段的五年存活率非小細(xì)胞肺癌為14-17％，小細(xì)胞肺癌僅為6％。臨床和流行病學(xué)研究表明肺部的慢性感染，慢性炎癥與肺癌之間有著非常密切的關(guān)聯(lián)。在慢性感染和慢性炎癥中免疫系統(tǒng)在維持組織平衡，細(xì)胞代謝，組織重構(gòu)，以及防止感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中包括很多不同的炎性組分，這些組分可以釋放多種細(xì)胞因子，趨化因子及細(xì)胞毒性介質(zhì)，成為促進(jìn)炎

2、性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。如活性氧(ROS)，金屬蛋白酶，白細(xì)胞介素，和干擾素等。癌癥相關(guān)炎癥影響到惡性腫瘤的許多方面，其中包括增殖和惡性細(xì)胞的存活，腫瘤血管生成，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，以及腫瘤對(duì)化療藥物和激素的敏感性。
　　肺癌是目前最常診斷的腫瘤，居男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，女性癌癥相關(guān)死亡原因的第二位。無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，乳腺癌和肺癌分別是在女性和男性中最常見(jiàn)的惡行腫瘤和癌癥死亡的首要原因。觀察肺癌在不同國(guó)家的發(fā)生及變

3、化趨勢(shì)或者是每個(gè)國(guó)家的男女性之間發(fā)生比率可以看出與煙草的使用頻率有非常密切的關(guān)系。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)，大約有20％的腫瘤與慢性感染有關(guān)，30％與吸煙及吸入污染物（例如二氧化硅和石棉）有關(guān)，35％與飲食因素有關(guān)（其中20％的腫瘤負(fù)荷與肥胖相關(guān)）。
　　現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合成酶(NOS)在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中有著重要的意義。首先發(fā)現(xiàn)的第一種一氧化氮合成酶(NOS)是從大腦神經(jīng)組織中純化出來(lái)的，命名為神經(jīng)元型NOS或Ⅰ型NOS(nNOS或NO

4、S-1);隨后發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)型NOS，稱為二型NOS(iNOS或NOS-2);后來(lái)又發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮型或Ⅲ型NOS(eNOS或NOS-3)。這三種不同類型的一氧化氮合成酶的基因分別位于三個(gè)不同的染色體。其中NOS2可以通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生，如脂多糖(LPS)或許多促炎細(xì)胞因子(IL-1，IFNγ，TNFa)，并在體內(nèi)迅速表達(dá)，產(chǎn)生大量的一氧化氮，并廣泛分布在不同類型的細(xì)胞中。過(guò)多的一氧化氮對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有重要的意義，并且在許多病理狀態(tài)下也會(huì)促進(jìn)一氧化

5、氮的產(chǎn)生，例如(1)組織急性損傷和各種炎癥性疾病(2)神經(jīng)系統(tǒng)疾病(3)的自身免疫性疾病(4)血管生成及相關(guān)疾病(5)糖尿病。
　　iNOS最先在小鼠的巨噬細(xì)胞中被分離出來(lái)。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生通過(guò)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶可以產(chǎn)生一氧化氮及活性氧，繼而產(chǎn)生過(guò)氧陰離子對(duì)體內(nèi)的微生物起殺傷作用。但是過(guò)量的一氧化氮，活性氧和過(guò)氧陰離子可以增加機(jī)體的氧化應(yīng)激和組織損傷，可以造成機(jī)體慢性炎癥的病理狀態(tài)。在一些慢性炎癥性疾病中，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是誘發(fā)腫瘤的

6、危險(xiǎn)因素之一。
　　在肺自發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌的小鼠模型(Lori-IKKαK44A/K44A)中發(fā)現(xiàn)，IKKα激酶失活，IKKα水平下調(diào)對(duì)小鼠肺鱗癌的發(fā)生有重要的促進(jìn)作用，在研究中發(fā)現(xiàn)其肺部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率與肺部的腫瘤微環(huán)境有密切的關(guān)系，在腫瘤組織及近端癌旁組織中發(fā)現(xiàn)了iNOS及炎性細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)增高。這也與人類的發(fā)病狀況相似。同時(shí)該研究中通過(guò)剔除巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可以降低肺腫瘤組織中的炎性細(xì)胞因子明顯降低。為了進(jìn)一步觀察iNOS

7、在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要作用。我們?cè)谶@個(gè)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上通過(guò)基因雜交技術(shù)將小鼠的iNOS基因敲除(iNOS-/-)，觀察小鼠腫瘤的發(fā)生率影響及iNOS對(duì)腫瘤的治療作用。
　　研究目的:
　　通過(guò)iNOS基因敲除小鼠觀察iNOS信號(hào)通路在肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用，探討iNOS在人肺鱗狀細(xì)胞癌中治療意義。
　　研究對(duì)象:
　　本研究中所有小鼠均按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)動(dòng)物管理與應(yīng)用委員會(huì)(IACUC

8、)制定的指南為原則，在相對(duì)無(wú)菌潔凈的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。通過(guò)基因雜交技術(shù)以FVB小鼠為基礎(chǔ)雜交L-IKKαK44A/K44A小鼠與L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-小鼠。以第七代至第九代小鼠為觀察對(duì)象，分成WT、L-IKKαK44A/K44A、L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-三組，每組選取50只為觀察對(duì)象，其中18只持續(xù)每天觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)食狀況，皮膚毛發(fā)的脫落情況，呼吸頻率及呼吸困難的程度，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)進(jìn)行無(wú)痛處

9、死，留取肺臟、脾臟組織。
　　研究方法:
　　1.通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選所需基因型的小鼠，包括Loricrin基因陽(yáng)性，IKKαK44A/K44A及NOS2-/-基因突變純合子的小鼠。根據(jù)需要保留雜合子小鼠用于傳代。
　　2.熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)。用TRIzol溶液提取組織及細(xì)胞中的RNA，用Tetro cDNA Synthesis Kit(BIOLINE，USA)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后檢測(cè)三組小鼠肺

10、臟組織中IL4，IL5，IL10，IL17a的RNA水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)用Real-time PCR for RT2 Profiler PCR-array檢測(cè)三組小鼠肺臟及CD4+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子及趨化因子的變化趨勢(shì)。
　　3.用流式細(xì)胞儀分離提取脾臟CD4+T細(xì)胞。每組選取6-8周齡小鼠3-5只，通過(guò)PE CD4，APC-Cy7 CD8，及7ADD標(biāo)記脾臟細(xì)胞，分離提取出CD4陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞，提取RNA后檢測(cè)細(xì)胞因

11、子水平。
　　4.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠肺臟中的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量。每組選取10-12周齡小鼠3-5只，孵育肺臟細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)記抗體: FITC CD45，PE CD11c, PE-Cy7 CD11b, APC F4/80,APC-Cy7 MHCⅡ,700 GR1。淋巴細(xì)胞標(biāo)記抗體:FITC CD45，PE CD4，PE-Cy78220，APC CD3，APC-Cy7CD8。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　5.用免疫雜交印記分析

12、(Western blot)的方法檢測(cè)小鼠肺臟組織中Trim29，環(huán)氧化酶-2(COX-2)的變化，每組小鼠選取5月齡，3只，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞中iNOS及Argeanse-1的變化，每組小鼠選取6-8周，3只，重復(fù)3次。
　　6.小鼠骨髓移植。選取6-8周齡的三組小鼠，每組5只，接受γ射線照射后進(jìn)行骨髓移植。供體為12周L-IKKαK44A/K44A，L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-兩組小鼠。移植前1周和

13、移植后2周受體小鼠接受含有抗生素的水喂食。接受移植后2個(gè)月處死小鼠觀察小鼠的肺部腫瘤發(fā)生率。
　　7.用8-0H-DG對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行免疫熒光染色。分別選取6月齡的小鼠的肺臟組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，每組3只，觀察肺臟細(xì)胞中DNA損傷的變化。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism5制圖統(tǒng)計(jì)軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用t-TEST進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

14、研究結(jié)果:
　　1.在持續(xù)觀察的18只小鼠中，F(xiàn)VB作為陰性對(duì)照均可健康成活一年。L-IKKαK44A/K44A組中的小鼠在六個(gè)月時(shí)有15只小鼠，肉眼均可見(jiàn)肺部腫瘤，病理學(xué)切片顯示均為肺鱗狀細(xì)胞癌，其余3只在7-10個(gè)月時(shí)陸續(xù)死亡，病理結(jié)果也均為肺鱗狀細(xì)胞癌。L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-組中在6個(gè)月時(shí)12只小鼠中有1只死亡，肉眼可見(jiàn)肺部腫瘤，病理結(jié)果為鱗癌，其余11只處死后，其中1例病理學(xué)結(jié)果顯示肺鱗癌，剩余6只持

15、續(xù)觀察，小鼠伴有部分皮膚炎癥的表型，但都可以存活至12個(gè)月，處死后肉眼及病理學(xué)切片均未發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤。因此我們將WT、Lori-IKKαK44A/K44A、 Lori-IKKαK44A/K44ANOS2-/-三組進(jìn)行比較。通過(guò)三組小鼠組織病理學(xué)切片HE染色對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Lori-IKKα K44A/K44ANOS2-/-組較Lori-IKKαK44A/K44A組肺組織炎性浸潤(rùn)明顯減少，用免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組小鼠肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果

16、顯示Lori-IKKα K44A/K44ANOS2-/-組較Lori-IKKαK44A/K44A組肺臟巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，p＜0.001，有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.為了證實(shí)iNOS在骨髓中的作用，我們分別用L-IKKαK44A/K44A和L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-小鼠的骨髓，移植到三組小鼠體內(nèi)，2個(gè)月后觀察小鼠腫瘤的發(fā)生情況。結(jié)果顯示無(wú)論是受體或供體，存在iNOS-/-的小鼠肺部腫瘤的發(fā)生率都較iNOS+/

17、+有明顯的降低，而且在巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)的更加明顯，說(shuō)明iNOS不僅可以在組織上皮細(xì)胞中可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且在巨噬細(xì)胞中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制過(guò)程起著更加重要的作用。
　　3.免疫雜交印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肺臟Trim29和COX2的表達(dá)都有顯著的下降，說(shuō)明在iNOS-/-小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平下降，可以減少細(xì)胞的DNA損傷，同時(shí)8-OH-DG的免疫熒光染色也進(jìn)一步證實(shí)了該項(xiàng)結(jié)果。
　　4.用Real-time

18、PCR的方法檢測(cè)小鼠肺臟及T淋巴細(xì)胞的炎癥性因子的變化，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較陽(yáng)性對(duì)照組IL5，IL17a均降低，p＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1)iNOS在肺鱗狀細(xì)胞癌及其周圍微環(huán)境中的表達(dá)明顯增高，同時(shí)iNOS可以趨化巨噬細(xì)胞向腫瘤及腫瘤周圍組織聚集，加重腫瘤炎癥環(huán)境的加重，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。
　　2)通過(guò)NOS2-/-小鼠觀察到，iNOS水平降低可以明顯的降低腫瘤的發(fā)生率、延長(zhǎng)小鼠的生存期。