抗Thy-1腎炎模型基因表達譜和蛋白質(zhì)表達譜研究.pdf

1、背景與目的：
　　 系膜增殖是慢性腎小球腎炎常見的病理表現(xiàn)，由于發(fā)病機制不清，缺乏有效的治療措施。抗Thy-1腎炎模型是經(jīng)典的系膜增殖性腎炎模型，主要表現(xiàn)為可逆的系膜細胞增殖。本研究通過分析抗Thy-1腎炎模型不同時間點腎臟的基因表達譜和蛋白質(zhì)表達譜，篩選與系膜增殖相關的基因和蛋白質(zhì)，為系膜增殖性腎炎的發(fā)病機制及其干預措施的研究提供候選基因和干預靶點。
　　 材料和方法：
　　 1、模型的制備：200g健康雄性W

2、istar大鼠，隨機分為對照組（6只）和模型組（30只）。對照組尾靜脈注射生理鹽水，模型組一次性尾靜脈注射抗Thy-1抗體（2.5mg/kg），制備抗Thy-1腎炎模型，分別于0d（對照組）、3d、5d、7d、10d、14d（均為模型組，分別代表抗體注射后第3、5、7、10、14天）處死大鼠。
　　 2、基因表達譜分析：提取腎臟皮質(zhì)RNA，利用Affymetrix U2302.0芯片（包含31000個探針位點，代表28000個大

3、鼠基因），分析各時間點大鼠的基因表達譜。利用SAM軟件進行數(shù)據(jù)處理，得到模型組各時間點與對照組比較的差異表達基因；利用Cluster3.0軟件對差異表達基因和其中的轉錄相關基因進行系統(tǒng)聚類分析；利用Gominer軟件和MAS系統(tǒng)分別進行基因的生物進程和分子功能分析；利用KEGG數(shù)據(jù)庫分析分子通路變化；用定量PCR對TIMP-1、CCL2、S100A4、KLF15、MXI1進行驗證。
　　 3、蛋白質(zhì)組學分析：提取大鼠腎小球蛋白質(zhì)

4、，采用Cy2、Cy3、Cy5分別標記各樣本。24cm pH3-11 NL strip和12.5％聚丙烯酰胺凝膠進行雙相分離，利用Decyder軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析；從制備膠中切取差異表達蛋白質(zhì)點，利用飛行時間質(zhì)譜和液質(zhì)聯(lián)用方法鑒定差異表達蛋白質(zhì)，然后進行系統(tǒng)聚類分析。Western blot驗證FHL2、NIT2蛋白質(zhì)的表達。
　　 結果：
　　 1、抗Thy-1腎炎模型的病理改變和血、尿檢測：（1）大鼠腎組織病

5、理改變：模型腎臟在3d時出現(xiàn)系膜溶解，5d時出現(xiàn)系膜增殖，7d時出現(xiàn)重度的系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)積聚，10d系膜增殖開始消退，14d系膜增殖顯著消退。（2）24hr尿蛋白定量：模型組大鼠3d、5d、7d、10d尿蛋白定量顯著高于對照組，其中3d是高峰；（3）血肌酐和尿素氮：模型組大鼠5d和7d血肌酐和尿素氮顯著高于對照組，其中7d是高峰。
　　 2、抗Thy-1腎炎模型腎臟基因表達譜分析：（1）SAM軟件分析結果顯示，與對照組

6、比較，模型組3d、5d、7d、10d、14d的差異表達基因數(shù)量分別是30、952、494、154、861個。（2）系統(tǒng)聚類分析結果顯示，模型組差異表達基因的變化趨勢可以分為5種類型：第1類變化趨勢：在5d和成7d表達上調(diào)至高峰，10d和/或14d下調(diào)；第2類變化趨勢：在5d和/或7d表達下調(diào)至低點，10d和/或14d上調(diào)；第3類變化趨勢：在5d和/或7d表達下調(diào)，10d上調(diào)，14d下調(diào)；第4類變化趨勢，在5d和/或7d表達開始下調(diào)，10

7、d和/或14d下調(diào)至最低點；第5類變化趨勢，在5d和/或7d表達開始上調(diào)，10d和/或14d上調(diào)至最高峰。在各個類型中，都有增殖和凋亡相關的基因差異表達。（3）GO分析結果顯示，模型組各時間點的差異表達基因主要參與代謝、生物調(diào)節(jié)、信號轉導、應激等生物進程和催化活性、分子結合等分子功能。（4）轉錄相關基因系統(tǒng)聚類分析結果顯示，轉錄相關基因表達變化趨勢主要集中在以下2類：一類在5d和/或7d上調(diào)至峰值，10d和/或14d表達下調(diào)，以促凋亡基

8、因和抑增殖基因為主；另一類在5d和/或7d開始下調(diào)，14d下調(diào)至最低值，以促凋亡基因為主。（5）分子通路分析結果顯示，模型組5d、7d、10d、14d發(fā)生變化的分子通路數(shù)量分別是28、24、9、22條。與細胞增殖相關的分子通路主要包括局部粘附、縫隙連接、緊密連接、細胞骨架調(diào)節(jié)、p53信號通路、細胞周期、細胞因子與受體相互作用、細胞粘附分子、MAPK信號途徑等。在系膜增殖期，這些通路被激活；在系膜增殖恢復期，局部粘附、縫隙連接、細胞周期等

9、通路被抑制。（6）定量PCR檢測TIMP-1、CCL2、S100A4、KLF15、MXI1基因表達表達趨勢與芯片中的結果基本一致。
　　 3、抗Thy-1腎炎模型蛋白質(zhì)組學分析：（1）利用Decyder軟件，在模型組中共發(fā)現(xiàn)了108個差異表達蛋白質(zhì)。利用Maldi-Tof-MS和LTQ技術進行鑒定，共鑒定出了40個差異表達蛋白質(zhì)，這些差異表達蛋白質(zhì)主要參與代謝、應激、生物調(diào)節(jié)等生物進程和催化活性、分子結合等分子功能。（2）系統(tǒng)聚

10、類分析結果顯示：差異表達蛋白質(zhì)的變化趨勢主要集中在以下2類：一類是10d和/或14d表達下調(diào)，包括促增殖和抑增殖蛋白質(zhì)；另一類是10d和/或14d表達上調(diào)，以抑增殖蛋白質(zhì)為主。（3）驗證：用Western blotting驗證了FHL2和NIT2蛋白質(zhì)表達，檢測結果與蛋白質(zhì)組學檢測結果一致。
　　 結論：
　　 無論是抗Thy-1腎炎的系膜增殖期還是增殖恢復期，都有增殖和凋亡相關的基因差異表達，其中包括相關的轉錄基因。各