c57小鼠肝組織微粒體蛋白質組表達譜的研究.pdf

1、微粒體是指細胞勻漿通過差速離心和蔗糖密度梯度離心，去除核組分和線粒體組分后，獲得的由破碎的內(nèi)質網(wǎng)自我融合形成的近球形的膜囊泡狀結構。大部分膜囊來自于內(nèi)質網(wǎng)，也包括其他膜性細胞器的成分，如高爾基體、過氧化物酶體、內(nèi)涵體、線粒體外膜、內(nèi)吞小體，以及肝實質細胞、Kupffer 細胞和內(nèi)皮細胞的質膜。簡而言之，微粒體代表的是主要來自于內(nèi)質網(wǎng)的細胞內(nèi)膜系統(tǒng)。內(nèi)質網(wǎng)在細胞內(nèi)起著重要作用，除了參與蛋白質的合成分泌和修飾加工外，還包括了一大部分參與糖代

2、謝、脂代謝及生物轉化的蛋白。因此，微粒體的蛋白質組學研究有助于闡明蛋白質一蛋白質和磷脂一蛋白質之間的相互作用，蛋白質的生物學功能以及結合于膜上的酶的功能特性等。 本研究應用差速離心和蔗糖密度梯度離心從c57小鼠(BL-6)肝組織勻漿中抽提得到高純度的微粒體。行Western-b10t實驗以檢驗其純度及污染物的含量。直接應用雙向凝膠電泳技術(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)分離純化

3、后的肝微粒體：同時考慮到構成微粒體的絕大部分為膜組分，而2一DE在膜蛋白的分離方面有較大的困難，因此我們先用Na<,2>CO<,3>抽提出微粒體中的膜蛋白，再用一維SDS—PAGE技術分離膜蛋白。兩種方法所分離的蛋白均由ESIQ-TOF予以鑒定。并利用生物信息學資源對所鑒定蛋白質的功能和亞細胞定位等進行分析。 本研究初步建立了c57小鼠肝微粒體蛋白質表達譜。直接對微粒體進行分離的2D參考膠上平均展示點數(shù)為1028±83個。選取2

4、04個分辨較好的蛋白質點進行鑒定，鑒定出蛋白質185個，其中52個蛋白通過Swiss-prot數(shù)據(jù)庫檢索被確定為內(nèi)質網(wǎng)固有蛋白。內(nèi)質網(wǎng)標志性蛋白如GRP94、GRP99、及UDP-葡糖醛酰轉移酶1-7前體均得到準確鑒定。Na<,2>CO<,3>處理后的微粒體膜組分經(jīng)SDS PAGE分離后，ESIQ-TOF鑒定出99個蛋白，其中59個為膜蛋白。鑒定出的蛋白中有28個定位于內(nèi)質網(wǎng)上。內(nèi)質網(wǎng)標志性膜蛋白：細胞色素P-450和b5，鈣網(wǎng)蛋白，以