肝郁證模型大鼠藍斑蛋白質組差異表達研究.pdf

1、背景：辨證論治是中醫(yī)學的特色和精髓，突出了個性化的中醫(yī)思路?！白C”是中醫(yī)學的一個特有概念，是對疾病過程中所處一定階段的病位、病因、病性以及病勢所作的病理性概括。證是機體內因和環(huán)境外因綜合作用的機體反應狀態(tài)，隨著病程的發(fā)展而不斷發(fā)生變化。證是對疾病當前本質所作的結論。因此，證的研究是中醫(yī)學現代化研究的核心內容。近年來，隨著基因組測序工作的完成，人們研究的重點已經從基因轉移到蛋白質功能方面，蛋白質在疾病的發(fā)生發(fā)展中承擔著重要的角色，這使得蛋

2、白質組學在人類疾病的研究中有著極為重要的價值。蛋白質組學是一門在整體水平上高通量、大規(guī)模地研究蛋白質組成及其動態(tài)變化的活動規(guī)律，從而得到疾病、生理生化過程中的整體情況的新興學科。蛋白質組學從一個機體或一個組織，一個細胞等不同層次“整體”的蛋白質活動的角度，來揭示和闡明證候形成和發(fā)展的基本規(guī)律。其理論和技術特點以及其整體、動態(tài)性的核心思想，與中醫(yī)學的“整體觀”和“辨證觀”等理論體系有很大的相似性，這種研究思路與中醫(yī)整體觀和中藥多靶點整合調

3、節(jié)的特點不謀而合，具有明顯的中醫(yī)特色肝郁證是由于肝的疏泄功能異常，疏泄不及而致氣機郁滯所引起的情緒不寧、胸脅悶脹或易怒善哭為特征的一類臨床病證，常見于臨床多種疾病。臨床流行病學調查顯示，肝臟病證在五臟病證中占總體病證的40％，而肝郁證又是肝病證候的核心，也是中醫(yī)肝病發(fā)病學的重要環(huán)節(jié)，因此肝郁證的本質研究一直是中西醫(yī)結合領域研究的熱點。近年來對肝郁證本質的研究頗多，2初步證實肝郁證具有現代病理生理學基礎，并部分地闡釋了中醫(yī)理論的科學性，取

4、得了階段性成果:認為肝郁證和應激密切相關，并涉及機體神經、內分泌、循環(huán)、消化、免疫等多系統(tǒng)多器官的病理改變。近年來對應激相關的下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(tǒng)(Hypothalamic Pituitary Gonadal Axis，HPA)和藍斑-交感-腎上腺髓質系統(tǒng)(locus coeruleus-sympathetic-adrenal medulla system，LC-NE)研究較多，我們課題組之前的研究表明肝郁證可引起藍斑中酪氨酸羥

5、化酶(tyrosinehydroxylasw, TH)、c-fos表達的上調，進一步闡明了藍斑和肝郁證的相關性。肝郁證是中醫(yī)經典病證，其方證研究也一直是其本質研究的一個重要方面。中醫(yī)證候研究具有“以方測證，方證互參”的特點。一方面通過辨證的結果來確立相應的治法方藥，一方面又根據方藥的組成和功效來推測疾病的病機和癥狀。理論上講，每一個方劑都有自己使用的病證，只有當其功效與疾病的病機相應時，方劑的效用才達到最佳。通過這一特征，我們可以通過建

6、立預設的動物疾病模型，然后給予預設的方藥，選擇和疾病證候相關的差異指標，通過對用藥后動物的觀察和研究，確認該模型是否為預設的疾病模型。同時，在確定模型的情況下，選用特定方劑，通過觀察差異指標，可以證實該方劑是否是治療此病證的有效方劑。因此，本課題以藍斑為切入點，通過蛋白質組學進行差異蛋白鑒定，并從中選取鑒定出的已知蛋白羧肽酶A抑制劑(Latexin/endogenous carboxypeptidaseinhibitor, ECI)，沉

7、默信息調節(jié)基因2(silent information regulator2，Sirt2)，轉體基因蛋白(Transthyretin，TTR)，進行進一步的驗證，并通過逍遙散進行反證，同時選用了西藥陽性對照鹽酸氟西?。ǚ魍∈桥R床經典抗抑郁藥，可有效改善悶悶不樂，興趣減退等肝郁證癥狀），希望為藍斑和肝郁證的相關性提供更進一步的證據，并對進一步研究肝郁證的本質打下一定的基礎。
　　 目的：采用孤養(yǎng)加慢性不可預知溫和刺激(chron

8、ic unexpected mild stress，CUMS)制備肝郁證大鼠模型，觀察肝郁證大鼠在一般狀態(tài)、行為學及從蛋白質的角度，對肝郁證模型大鼠藍斑組織蛋白質組的差異表達進行比較分析并進行驗證，從動物模型的角度找到肝郁證相關的蛋白質組群，從而為建立證候的微觀辨證指標體系奠定基礎，也為從臨床疾病的角度對肝郁證相關蛋白質組的全面研究提供技術和理論支持。并通過比較逍遙散組和氟西汀組與模型組大鼠之間的蛋白表達差異，探討逍遙散對肝郁證的作用機

9、理，并以方測證，方證互參，為肝郁證本質的闡述提供客觀依據。
　　 方法：⑴分兩次造模，第一次用于差異蛋白的檢測和鑒定，第二次用于蛋白功能的驗證。參照相關文獻報道，從慢性心理應激的角度出發(fā)，將18只雄性SD大鼠隨機分為正常組，模型組，逍遙散組，每組6只（第二次為72只，分組增加鹽酸氟西汀組，每組18只）。除正常組外，其他各組大鼠均單籠飼養(yǎng)，并給予慢性不可預知溫和刺激，每天2次，持續(xù)3周。逍遙散組在模型制備的基礎上加用逍遙散干預，氟

10、西汀組加用氟西汀干預，正常組不給任何干預，群養(yǎng)。⑵以液氮研磨藍斑組織，低溫裂解藍斑細胞，提取藍斑組織的蛋白質樣本。采用BSA法對蛋白質樣本進行定量。對組內的藍斑組織，按等質量進行樣本混合。⑶在常規(guī)蛋白質組2-DE分離技術基礎上，引入“鹽橋”和低電壓除鹽方法，進一步優(yōu)化藍斑組織蛋白質組2-DE分離技術。對同類混合樣本以組間配對的形式，同時進行2-DE分離，并重復3次。⑷對2-DE分離所獲得的凝膠，采用新型的膠體考染技術，不僅可以提高凝膠染

11、色的靈敏度，而且還能減少對后期質譜檢測的干擾。凝膠經過染色和脫水后，用光密度透射掃描儀掃描而形成圖像。用PDQuest7.0軟件分析凝膠圖像，獲取每個蛋白質的表達量、等電點、分子量等信息。并將組間表達量相差2倍以上的蛋白質斑點設定為差異表達蛋白質，由軟件自動生成分析結果，再加以人工驗證。⑸用MALDI-TOF-MS對分析所獲得的差異蛋白質斑點進行肽質量指紋(peptide mass figerint，PMF)的檢測。首先，在凝膠上切取差

12、異表達蛋白質斑點，再經水洗、脫色、還原與烷基化、酶解、萃取、點樣和質譜分析等步驟獲取每個蛋白質斑點的PMF。然后，利用Masoct軟件搜索各大生物和蛋白質相關數據庫，尋找與目的PMF相匹配的蛋白質，并查詢該蛋白質的相關信息。⑹運用化學發(fā)光免疫法檢測各組大鼠血清中三碘甲狀腺氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)和促甲狀腺激素(TSH)含量。⑺運用蘇木精-伊紅(hematoxylinandeosinstain，HE)染色，觀察大鼠藍斑的形態(tài)學變化。

13、⑻用免疫組化法（immunology and histology chemistry, IHC）檢測藍斑中Laxetin、Sirt2和TTR的表達變化。用Imageproplus6.0軟件進行分析。⑼運用免疫印跡法(weastem blot，WB)檢測Laxetin、Sirt2和TTR在藍斑中的表達變化。⑽用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time-polymerase chain reaction，real-timePCR)技術檢

14、測Laxetin、Sirt2和TTR中mRNA在藍斑中的表達情況。⑾實驗結果均用平均值土標準差（(X)±S）表示，采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計包處理。體重的變化采用重復測量數據的方差分析，其余指標多樣本均數比較采用單因素方差分析，方差齊性，多重比較采用LSD法檢驗，若方差不齊，采用Welch分析，多重比較采用Tamhane's T2法檢驗，以P＜0.05作為具有顯著性差異。
　　 結果：①成功制備了孤養(yǎng)加CUMS肝郁證大鼠模型。

15、造模3周后，從一般情況來看，模型組大鼠開始表現為躁動，易激惹，隨后逐漸安靜，表現為倦怠少動，喜歡貼壁，反應遲鈍，食欲減退，伴有毛色暗淡無光澤，松散，大便稀軟等肝郁證表現。逍遙散組和氟西汀組上述反應明顯低于模型組，且兩藥物組間無顯著性差異(P＞0.05)。而正常對照組未見異常行為狀態(tài)。各組間體重增長存在顯著差異(P=0.017)，模型組生長較緩慢，逍遙散組和氟西汀組服藥后體重增長緩慢的情況得到改善，且與模型組有顯著差異(P=0.000)。

16、糖水消耗實驗提示各組間糖水偏好存在顯著性差異((P=0.000)，模型組的糖水偏好度明顯小于其他組。曠場實驗發(fā)現模型組大鼠的直立次數和爬格數均顯著低于正常組(P=0.000)，逍遙散組和氟西汀組則顯著優(yōu)于模型組，但和正常組比較仍有差異(P=0.000)。說明孤養(yǎng)加CUMS確能造成大鼠的肝郁證，能有效的模擬臨床中肝郁證興趣喪失、快感缺乏等癥狀。②獲得了高質量的藍斑組織蛋白質組2-DE凝膠電泳圖像。經2-DE分離和對凝膠圖像的軟件分析，發(fā)現

17、了21個蛋白質斑點在三組間（正常組，模型組，逍遙散組）有差異表達。③差異蛋白質斑點的質譜檢測:出峰率達100％，經過對PMF的分析和數據庫檢測，確定肝郁證模型大鼠中表達具有顯著性差異的藍斑組織蛋白質17個。④血清中T3和T4含量在模型組中最高，逍遙散組和氟西汀組次之，正常組中含量最低(P=0.000)，TSH含量則在各組大鼠間的差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.740)。⑤HE染色顯示各組大鼠藍斑無明顯的形態(tài)學改變。⑥IHC檢測發(fā)現模型組藍斑

18、Laxetin、Sirt2和TTR的陽性神經元數目均小于正常組，染色強度減弱，平均光密度值也低于正常組。逍遙散組和氟西汀組則可以改善這種情況。⑦WB檢測模型組Laxetin、Sirt2和TTR的表達量均低于正常組，逍遙散組和氟西汀組則較模型組表達增加。⑧運用real-time PCR技術檢測Laxetin、Sirt2和TTR的mRNA在LC中的表達，發(fā)現與正常組比較，模型組表達量均減少，逍遙散組和氟西汀組則較模型組升高。
　　

19、結論：對肝郁證孤養(yǎng)加CUMS動物模型進行了藍斑的蛋白質組的研究，通過分析模型大鼠藍斑組織蛋白質組的差異表達，獲得和肝郁證動物模型密切相關的差異蛋白21個，其中17個可以獲得數據庫的匹配信息，確定蛋白質名稱。我們在這17個蛋白質中選取了Laxetin、Sirt2和TTR這三種蛋白進行進一步的驗證。后期驗證我們采用IHC、WB、real-time PCR三種實驗技術同時證明在肝郁證中Laxetin、Sirt2和TTR蛋白表達下降，且逍遙散和