早期自然流產(chǎn)蛻膜組織基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、正常蛻膜組織是母一胎界面間一個(gè)非常復(fù)雜而又高度協(xié)調(diào)的微環(huán)境，它由多種細(xì)胞如侵襲至蛻膜的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(eXtravilloustrophoblast，EVT)、子宮內(nèi)膜源性細(xì)胞(如上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)、骨髓源性細(xì)胞(如大顆粒淋巴細(xì)胞、蛻膜巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和少許B細(xì)胞)構(gòu)成，這些細(xì)胞以及由這些細(xì)胞、母體和胎兒所分泌到蛻膜的細(xì)胞因子共同形成了母-胎間信息交流的平臺(tái)，并對(duì)胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞“有控性”侵襲、子宮內(nèi)膜的免疫容受性、蛻膜化和胎盤(pán)的形成

2、進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控。一旦蛻膜組織的這種精細(xì)調(diào)控失去平衡，如某些基因的表達(dá)變化或某種細(xì)胞因子發(fā)生變化(如基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs與其抑制劑TIMPs表達(dá)失去平衡)，蛻膜組織微環(huán)境的精細(xì)調(diào)控就會(huì)被打破，母體就會(huì)對(duì)胎兒產(chǎn)生排斥反應(yīng)，導(dǎo)致胚胎流產(chǎn)。 早期自然流產(chǎn)是指在娠妊12周之前非故意終止的宮內(nèi)妊娠，是臨床常見(jiàn)的病理妊娠之一，其發(fā)生率占全部自然流產(chǎn)的62％以上。在這些流產(chǎn)病例中，相當(dāng)一部分的流產(chǎn)動(dòng)病因不明。近年來(lái)，隨著子宮內(nèi)膜容受性、蛻膜組

3、織病理學(xué)研究表明，胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞有控性侵襲子宮內(nèi)膜是胚胎正常發(fā)育的基礎(chǔ)，而這種機(jī)制的形成正是以子宮內(nèi)膜正常蛻膜化為前提。而早期自然流產(chǎn)的蛻膜組織，其蛻膜微環(huán)境發(fā)生了哪些變化?這些變化與自然流產(chǎn)的內(nèi)在聯(lián)系如何?以往人們一直試圖從蛻膜組織中某一特定的基因或蛋白作為突破口，探尋其與自然流產(chǎn)發(fā)生的關(guān)系，但多是從單一基因或單一蛋白分子的角度去研究，而從基因表達(dá)譜或蛋白質(zhì)組學(xué)整體水平變化上去探尋自然流產(chǎn)的病因尚未見(jiàn)報(bào)道。目前，大規(guī)模的基因表達(dá)譜和蛋白

4、質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，其中寡核苷酸芯片、DNA微陣列以及基因表達(dá)系列分析是應(yīng)用最為廣泛和最有效的基因表達(dá)分析技術(shù)。 目前已有的人類全基因組芯片U133 plus2.0，包含了39000個(gè)轉(zhuǎn)錄本，代表了33000個(gè)人類明晰的基因，由A和B兩張芯片組成，包括100多萬(wàn)個(gè)探針矩陣，序列來(lái)源于GenBank,dbEST,refseq數(shù)據(jù)庫(kù)。利用U133 plus2.0芯片，可以高通量地對(duì)自然流產(chǎn)蛻膜的基因表達(dá)變化進(jìn)

5、行分析。而二維電泳(two-dimensional gel electrophoresis)和質(zhì)譜(mass spectrometry)技術(shù)，主要用于研究基因轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、氨基酸序列和修飾方式等。因此，我們借助于基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，分析了自然流產(chǎn)蛻膜組織的基因表達(dá)變化和基因轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，獲得了自然流產(chǎn)蛻膜組織細(xì)胞的基因表達(dá)譜和蛋白表達(dá)譜，為探索自然流產(chǎn)的分子基礎(chǔ)和可能的發(fā)生機(jī)制以及自然流產(chǎn)的病因診斷、預(yù)防和

6、治療奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 通過(guò)人類全基因組芯片U133 plus2.0分析，我們觀察到了自然流產(chǎn)蛻膜組織中1876個(gè)基因表達(dá)的變化，其中基因表達(dá)上調(diào)的1004個(gè)，下調(diào)的872個(gè)。對(duì)1876個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行生物學(xué)功能檢索發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因上調(diào)37個(gè)、下調(diào)32個(gè)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因上調(diào)83個(gè)、下調(diào)47個(gè)；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因上調(diào)71個(gè)、下調(diào)59個(gè)；細(xì)胞生長(zhǎng)/維持相關(guān)基因上調(diào)85個(gè)、下調(diào)88個(gè)；代謝相關(guān)基因上調(diào)103個(gè)、下調(diào)86個(gè)

7、；凋亡相關(guān)基因上調(diào)55個(gè)、下調(diào)27個(gè)；物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因上調(diào)67個(gè)、下調(diào)77個(gè)；細(xì)胞周期相關(guān)基因上調(diào)21個(gè)、下調(diào)23個(gè)；應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)9個(gè)、下調(diào)3個(gè)；細(xì)胞防御反應(yīng)相關(guān)基因上調(diào)28個(gè)、下調(diào)7個(gè)；免疫應(yīng)答相關(guān)基因上調(diào)41個(gè)、下調(diào)25個(gè)；細(xì)胞黏附相關(guān)基因上調(diào)3 1個(gè)、下調(diào)47個(gè)；發(fā)育相關(guān)基因上調(diào)81個(gè)、下調(diào)85個(gè)。此外，通過(guò)檢索，我們發(fā)現(xiàn)有558個(gè)基因尚無(wú)功能描述，其中上調(diào)293個(gè)、下調(diào)265個(gè)。對(duì)1318個(gè)已知功能基因進(jìn)行了Pathwa

8、y分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及MAPK、ERK、P38、Jak-STAT、Natural killer cell mediatedcytotoxicity、mTOR、Apoptosis等信號(hào)通路。經(jīng)過(guò)對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)綜合分析，我們認(rèn)為自然流產(chǎn)蛻膜組織涉及多基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、水解酶等相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，以及細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要因素。 2-DE圖譜顯示，自然流產(chǎn)蛻膜組織蛋白質(zhì)分子量(Mw)主要

9、集中在14-116 KDa范圍內(nèi)，等電點(diǎn)(pI)主要分布在pH 4.0-8.0之間。PDQuest軟件分析2-DE圖像，得到正常蛻膜和自然流產(chǎn)蛻膜組織蛋白點(diǎn)分別為613個(gè)和583個(gè)。以正常蛻膜為參照，自然流產(chǎn)蛻膜的蛋白點(diǎn)與其匹配率為78％，表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)有73個(gè)(上調(diào)38個(gè)，下調(diào)35個(gè))，其中蛋白表達(dá)上調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有23個(gè)，下調(diào)3倍以上的點(diǎn)有17個(gè)；僅在自然流產(chǎn)蛻膜中表達(dá)的蛋白點(diǎn)有22個(gè)，僅在正常蛻膜中表達(dá)的蛋白點(diǎn)有19個(gè)。對(duì)1

10、5個(gè)差異顯著的蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，9個(gè)蛋白點(diǎn)獲得了有意義的結(jié)果(p<0.05)：1，2號(hào)均為波形蛋白Vimentin，4號(hào)為鈣網(wǎng)織蛋白前體(Calreticulin precursor，CRP55)，7號(hào)為膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5)，8號(hào)為原肌球蛋白-4(Tropomyosin alpha-4)；11號(hào)為Endoplasmin precursor (glucoseregulated prote

11、in Grp94)，12號(hào)為蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3前體(Proteindisulfide-isomerase A3 precursor)，14號(hào)為膜聯(lián)蛋白A1(Phospholipase A2inhibitory protein，Annexin A1)，15號(hào)為α-烯醇化酶(α-enolase)。其中1、2、7、14、15號(hào)蛋白表達(dá)增加，8、11、12蛋白表達(dá)下降，4號(hào)蛋白僅在自然流產(chǎn)的蛻膜組織中表達(dá)。通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出的這些差異蛋白質(zhì)

12、，其功能涉及絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、自然流產(chǎn)蛻膜組織血管的重建及蛻膜細(xì)胞的凋亡等。我們對(duì)基因芯片中高表達(dá)(Signal Log Ratio=5.5)的基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)進(jìn)行了初步的功能學(xué)研究。 結(jié)果 發(fā)現(xiàn)MMP10在自然流產(chǎn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較高，而在正常蛻膜組織中表達(dá)較低，在細(xì)胞核已經(jīng)發(fā)生濃縮裂解的流產(chǎn)蛻膜組織細(xì)胞中，其胞漿為陰性，在Transwll實(shí)驗(yàn)中MMP10還能促進(jìn)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(HPT-8)的侵襲。