2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、第一章 PEG化的免疫脂質(zhì)復(fù)合物:用于肝癌基因治療的新型非病毒基因遞送系統(tǒng)
   目的:為了對(duì)肝癌進(jìn)行基因治療,我們研究了一種能夠在體內(nèi)將治療基因遞送至肝癌細(xì)胞中的高效、安全的非病毒基因遞送系統(tǒng)。
   方法:聚乙二醇修飾的免疫脂質(zhì)復(fù)合物(PILP),是一種新穎有效的非病毒基因遞送系統(tǒng)。PILP由DNA/聚乙烯亞胺(PEI25 kDa)多聚物及陰離子脂質(zhì)體組成。分別以五個(gè)不同脂質(zhì)/DNA摩爾比(50/1,90/1,130

2、/1,170/1和210/1)制備PILP。其中的陰離子脂質(zhì)體由POPC,(DSPE)-PEG2000和(DSPE)-PEG2000-biotin組成,然后采用抗生物素-蛋白鏈菌素-單克隆抗體結(jié)合技術(shù)結(jié)合具尋靶作用的單克隆抗體。
   結(jié)果:該載體具有很強(qiáng)的保護(hù)質(zhì)粒DNA不被核酸酶降解的能力,并且在4℃放置20天后,其粒徑和電位穩(wěn)定。以170/1的脂質(zhì)/DNA摩爾比制備的PILP在體外有最高的轉(zhuǎn)染效率,平均粒徑和電位分別為132

3、 nm,+9.5 mV。這些復(fù)合物毒性小并能有效地將基因轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞。4℃放置10天后,其體外轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著降低。用表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和熒光素酶的質(zhì)粒制備PILP,尾靜脈給藥,在體內(nèi)表現(xiàn)出靶向肝和腫瘤的基因表達(dá),而不同于PEI/DNA聚合物基因表達(dá)的肺部靶向性。
   結(jié)論:PILP是一種靶向肝細(xì)胞癌的基因遞送載體。
   第二章靶向hEGFR mRNA和 hTERT mRNA小干擾聯(lián)合基因治療
   目的:

4、將靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的shRNA-pDNA分別制備成PEG化的免疫脂質(zhì)復(fù)合物(PILP),考察針對(duì)這兩種基因聯(lián)合治療肝細(xì)胞癌的效果。
   方法:(1)將編碼靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的小發(fā)夾RAN(shRNA)的表達(dá)質(zhì)粒anti-hEGFR pDNA和anti-hTERT pDNA制備成免疫脂質(zhì)復(fù)合物8314/shRNA-pDNA/PILP(8314/anti-unrelated

5、 pDNA/PILP,8314/anti-hEGFR pDNA/PILP和8314/anti-hTERT pDNA/PILP),PILP制備時(shí),使用小鼠對(duì)人胰島素受體的83-14單克隆抗體(8314 MAb)。體外轉(zhuǎn)染肝癌SMMC-7721細(xì)胞,4天后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,采用RT-PCR檢測(cè)hEGFR基因水平。觀察各組8314/shRNA-pDNA/PILP對(duì)hEGFR表達(dá)的抑制作用并于4個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)(2,4,6 da

6、y)觀察8314/anti-hEGFR/PILP的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。(2)將2000,000個(gè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞種于裸鼠背部皮下10天后,每5天靜脈注射進(jìn)行基因治療,每只裸鼠尾靜脈注射8314/shRNA-pDNA/PILP40μg,聯(lián)合治療組同時(shí)注射8314/anti-hEGFR/PILP和8314/anti-hTERT pDNA/PILP各40μg,記錄各組荷瘤鼠存活時(shí)間,計(jì)算腫瘤抑制率。連續(xù)給藥5次后,使用免疫組化和West

7、ernBlot技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織的hEGFR蛋白水平,其基因水平檢測(cè)使用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法。
   結(jié)果:(1)將8314/anti-hEGFR pDNA/PILP復(fù)合物單獨(dú)或與8314/anti-hTERT pDNA/PILP復(fù)合物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞可誘導(dǎo)hEGFR序列特異性基因沉默效應(yīng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡得到了一致的結(jié)果。轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞4天后,細(xì)胞周期結(jié)果表明8314/anti-hTERT pDNA/PILP

8、處理組和共轉(zhuǎn)染組的G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組分別增加了17.62%和45.62%,進(jìn)入S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較對(duì)照組分別減少了35.49%和87.55%。細(xì)胞凋亡結(jié)果表明8314/anti-hEGFR pDNA/PILP處理組和共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總凋亡率分別為12.47%和29.59%。與對(duì)照組比較,8314/anti-hTERT pDNA/PILP處理組和共轉(zhuǎn)染組hEGFR基因水平分別下調(diào)了72.53%和78.68%。(2)體內(nèi)基因治療時(shí),與

9、對(duì)照組比,8314/anti-hEGFR pDNA/PILP處理組,8314/anti-hEGFRpDNA/PILP處理組和聯(lián)合治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率分別為36.32%,46.13%和74.04%。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明:與對(duì)照組比,anti-hEGFR pDNA組,8314/anti-hEGFRpDNA/PILP處理組和聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用且兩單基因治療組與聯(lián)合治療組間差異顯著(P<0.05),其余各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05

10、)。荷瘤鼠生存時(shí)間在單基因治療組與聯(lián)合治療組間的差別異有非常顯著性意義(P=0.002)。其余各組之間無(wú)差異(P=0.707)。8314/anti-hEGFR pDNA/PILP處理組和聯(lián)合治療組可將hEGFR基因表達(dá)下調(diào)66.71%和89.01%,將hEGFR蛋白水平分別降低56.72%和80.73%。
   結(jié)論:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明,靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的小干擾聯(lián)合基因治療較單基因治療的抑瘤作用更顯著,

11、兩者聯(lián)合運(yùn)用可產(chǎn)生顯著增強(qiáng)效應(yīng)。
   第三章 PILP介導(dǎo)的肝特異性shRNA-hTERT治療實(shí)驗(yàn)性人肝癌的實(shí)驗(yàn)
   目的:構(gòu)建肝特異性啟動(dòng)子載脂蛋白A-I(ApoAI)啟動(dòng)的靶向hTERTmRNA的治療質(zhì)粒,結(jié)合免疫脂質(zhì)復(fù)合物(PILP)技術(shù),實(shí)現(xiàn)有效和肝特異性的基因治療,以減小非靶向性基因表達(dá)可能產(chǎn)生的副作用。
   方法:用ApoAI啟動(dòng)子分別替換增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)質(zhì)粒pCMV-EGFP

12、中的CMV啟動(dòng)子和靶向hTERT mRNA的治療質(zhì)粒PU6-shTERT(編碼靶向hTERT mRNA內(nèi)的1031-1059核苷酸序列的小發(fā)夾RNA)中的U6啟動(dòng)子,構(gòu)建出質(zhì)粒pApoAI-EGFP和pApoAI-shTERT。用ExGen500體外轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2,SMMC-7721,Lo2,MCF7,TF-1a,ACC-2和IMR90細(xì)胞:48 h后,熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達(dá),72h后,測(cè)各處理組細(xì)胞的端粒

13、酶活性。將質(zhì)粒ApoAI-EGFP,CMV-EGFP,ApoAI-shTERT和U6-shEGFP分別制備成PILP,PILP通過(guò)受體特異性單克隆抗體(MAb),小鼠83-14 Mab對(duì)人胰島素受體或大鼠8D3 MAb對(duì)小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,靶向肝癌。將2000,000個(gè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞種于裸鼠背部皮下后,從第10天開(kāi)始,每5天靜脈注射PILP進(jìn)行小干擾基因治療。
   結(jié)果:體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP可導(dǎo)致

14、EGFP在所有細(xì)胞中表達(dá),而轉(zhuǎn)染pApoAI-EGFP后,EGFP的表達(dá)僅出現(xiàn)在肝源性細(xì)胞中,包括HepG2,SMMC-7721細(xì)胞和正常肝細(xì)胞Lo2。pU6-shTERT處理可抑制所有端粒酶陽(yáng)性的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和端粒酶活性。pApoAI-shTERT。處理僅抑制端粒酶陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和端粒酶活性,對(duì)無(wú)端粒酶活性的正常肝細(xì)胞無(wú)抑制作用。荷H22瘤的小鼠體內(nèi)基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明:用pCMV-EGFP處理的小鼠,EGFP在其肝,腫瘤,腦和肺中

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