半乳糖修飾的脂質體-魚精蛋白-DNA復合物的肝細胞靶向性研究.pdf

1、肝臟是人體重要的代謝器官，與人類許多遺傳性疾病、代謝性疾病、腫瘤密切相關。同時，肝臟是一個重要的蛋白質合成場所，其作為生物反應的靶器官能分泌大量蛋白質入血，改變生物行為與特征。這些均使肝臟成為重要的基因治療的靶向器官。然而，目前大多數(shù)的病毒和非病毒基因載體都缺乏細胞靶向性，從而限制了基因治療的體內應用。受體介導基因轉移是近年來發(fā)展起來的一種利用細胞表面受體對特異酉己體的識別和內吞作用，將與配體結合的外源基因轉移到細胞內進行表達的基因轉移

2、重要策略。 去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是哺乳動物肝實質細胞特有的一種數(shù)量豐富，高效的內吞受體。ASGPR能專一性識別、結合并內吞血液循環(huán)中末端帶有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白，利用這個特性可以將一些用于基因傳遞的陽離子脂質體經過半乳糖修飾以后，定向的轉入到肝臟細胞中發(fā)揮作用。 為了構建一種穩(wěn)定性好、具有靶向傳輸作用的基因載體，本文利用主要存在于肝臟細胞表面的

3、去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)對半乳糖基的特異性識別作用，以膽固醇為母體，設計合成了一系列膽固醇的半乳糖苷衍生物，制備帶有不同半乳糖苷的脂質體；然后與魚精蛋白-DNA縮合物作用形成半乳糖苷修飾的脂質體-魚精蛋白-DNA復合物(Galactosylatedliposome-protamine-DNA complexes，Gal-LPD)。 我們首先利用轉化的大腸桿菌大量擴增了實驗需要的報告基因LacZ質粒DNA，利用陰離子交換樹

4、脂分離純化了質粒，采用紫外分光光度法測定了其含量，通過計算A<,260>/A<,280>的比值，證明其純度符合要求；我們又采用瓊脂糖凝膠電泳進一步考察了質粒DNA的純度和構型，結果表明純化產物的純度和構型均符合要求。我們以膽固醇為母體，以不同長度的聚乙二醇作為連接膽固醇和半乳糖苷的功能橋試劑，分別連接了單半乳糖苷，季戊四醇為核心的三半乳糖苷和肌醇為核心的五半乳糖苷，共合成了18種不同鏈長和帶有不同數(shù)量半乳糖苷的膽甾半乳糖苷衍生物。

5、 我們采用熒光分光光度法，利用熒光染料Hoechst 33258與DNA結合發(fā)出熒光的原理，建立了DNA的含量測定方法。我們用薄膜-超聲法，制備了空白脂質體，并通過正交設計確定了脂質體的處方；隨后用合成的一系列不同鏈長和帶有不同數(shù)量半乳糖基的膽甾半乳糖苷制備空白脂質體，然后與適量的魚精蛋白-DNA復合物在室溫孵育后，得到18種半乳糖修飾的LPD(Gal-LPD)和用未修飾的膽固醇制備的空白脂質體與魚精蛋白-DNA縮合物孵育形成的LPD

6、0為對照LPD；通過測定LPDs的電位和粒徑， Gal-LPD的Zeta電位和粒徑隨著半乳糖基數(shù)量和鏈長的不同而變化。Gal-LPD在透射電鏡下觀察為規(guī)則的圓球；包封率均在85％以上，并且可以保護DNA不被核酸酶降解。 我們運用體外細胞培養(yǎng)技術，以pORF-LacZ為報告基因，考察了LPDs的體外細胞轉染能力。我們用LPDs分別轉染了肝癌細胞HepG2和肺癌細胞A549，結果發(fā)現(xiàn)在HepG2細胞中，單半乳糖苷修飾的LPDⅡb，三

7、半乳糖苷修飾的LPDⅢc和五半乳糖苷修飾的LPD Ⅳe的轉染效率分別比LPD0提高了1.6倍、1.8倍和2.1倍。而半乳糖化的LPDs在A549細胞中的轉染率與LPD0相比都有所下降，且隨著半乳糖基數(shù)量的增多轉染效率下降的也越多。而且半乳糖可以競爭抑制Gal-LPD在HepG2細胞中的轉染效率。進一步實驗表明DDAB與DNA的比例可以影響轉染效率，且轉染具有一定的劑量依賴性。MTT實驗分析表明Gal-LPDs對HepG2和L929細胞均