半乳糖修飾的脂質(zhì)體-魚精蛋白-DNA復(fù)合物的肝細(xì)胞靶向性研究.pdf

1、肝臟是人體重要的代謝器官，與人類許多遺傳性疾病、代謝性疾病、腫瘤密切相關(guān)。同時(shí)，肝臟是一個(gè)重要的蛋白質(zhì)合成場所，其作為生物反應(yīng)的靶器官能分泌大量蛋白質(zhì)入血，改變生物行為與特征。這些均使肝臟成為重要的基因治療的靶向器官。然而，目前大多數(shù)的病毒和非病毒基因載體都缺乏細(xì)胞靶向性，從而限制了基因治療的體內(nèi)應(yīng)用。受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移是近年來發(fā)展起來的一種利用細(xì)胞表面受體對(duì)特異酉己體的識(shí)別和內(nèi)吞作用，將與配體結(jié)合的外源基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的基因轉(zhuǎn)移

2、重要策略。 去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是哺乳動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特有的一種數(shù)量豐富，高效的內(nèi)吞受體。ASGPR能專一性識(shí)別、結(jié)合并內(nèi)吞血液循環(huán)中末端帶有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白，利用這個(gè)特性可以將一些用于基因傳遞的陽離子脂質(zhì)體經(jīng)過半乳糖修飾以后，定向的轉(zhuǎn)入到肝臟細(xì)胞中發(fā)揮作用。 為了構(gòu)建一種穩(wěn)定性好、具有靶向傳輸作用的基因載體，本文利用主要存在于肝臟細(xì)胞表面的

3、去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)對(duì)半乳糖基的特異性識(shí)別作用，以膽固醇為母體，設(shè)計(jì)合成了一系列膽固醇的半乳糖苷衍生物，制備帶有不同半乳糖苷的脂質(zhì)體；然后與魚精蛋白-DNA縮合物作用形成半乳糖苷修飾的脂質(zhì)體-魚精蛋白-DNA復(fù)合物(Galactosylatedliposome-protamine-DNA complexes，Gal-LPD)。 我們首先利用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌大量擴(kuò)增了實(shí)驗(yàn)需要的報(bào)告基因LacZ質(zhì)粒DNA，利用陰離子交換樹

4、脂分離純化了質(zhì)粒，采用紫外分光光度法測(cè)定了其含量，通過計(jì)算A<,260>/A<,280>的比值，證明其純度符合要求；我們又采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步考察了質(zhì)粒DNA的純度和構(gòu)型，結(jié)果表明純化產(chǎn)物的純度和構(gòu)型均符合要求。我們以膽固醇為母體，以不同長度的聚乙二醇作為連接膽固醇和半乳糖苷的功能橋試劑，分別連接了單半乳糖苷，季戊四醇為核心的三半乳糖苷和肌醇為核心的五半乳糖苷，共合成了18種不同鏈長和帶有不同數(shù)量半乳糖苷的膽甾半乳糖苷衍生物。

5、 我們采用熒光分光光度法，利用熒光染料Hoechst 33258與DNA結(jié)合發(fā)出熒光的原理，建立了DNA的含量測(cè)定方法。我們用薄膜-超聲法，制備了空白脂質(zhì)體，并通過正交設(shè)計(jì)確定了脂質(zhì)體的處方；隨后用合成的一系列不同鏈長和帶有不同數(shù)量半乳糖基的膽甾半乳糖苷制備空白脂質(zhì)體，然后與適量的魚精蛋白-DNA復(fù)合物在室溫孵育后，得到18種半乳糖修飾的LPD(Gal-LPD)和用未修飾的膽固醇制備的空白脂質(zhì)體與魚精蛋白-DNA縮合物孵育形成的LPD

6、0為對(duì)照LPD；通過測(cè)定LPDs的電位和粒徑， Gal-LPD的Zeta電位和粒徑隨著半乳糖基數(shù)量和鏈長的不同而變化。Gal-LPD在透射電鏡下觀察為規(guī)則的圓球；包封率均在85％以上，并且可以保護(hù)DNA不被核酸酶降解。 我們運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以pORF-LacZ為報(bào)告基因，考察了LPDs的體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力。我們用LPDs分別轉(zhuǎn)染了肝癌細(xì)胞HepG2和肺癌細(xì)胞A549，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中，單半乳糖苷修飾的LPDⅡb，三

7、半乳糖苷修飾的LPDⅢc和五半乳糖苷修飾的LPD Ⅳe的轉(zhuǎn)染效率分別比LPD0提高了1.6倍、1.8倍和2.1倍。而半乳糖化的LPDs在A549細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率與LPD0相比都有所下降，且隨著半乳糖基數(shù)量的增多轉(zhuǎn)染效率下降的也越多。而且半乳糖可以競爭抑制Gal-LPD在HepG2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明DDAB與DNA的比例可以影響轉(zhuǎn)染效率，且轉(zhuǎn)染具有一定的劑量依賴性。MTT實(shí)驗(yàn)分析表明Gal-LPDs對(duì)HepG2和L929細(xì)胞均