半乳糖化殼聚糖-低分子量聚乙烯亞胺-DNA復合物的肝靶向性基因轉(zhuǎn)導研究.pdf

1、目的：構建去唾液酸糖蛋白受體介導的半乳糖基-殼聚糖-聚乙烯亞胺肝靶向非病毒轉(zhuǎn)基因載體，研究其在體內(nèi)外的肝靶向轉(zhuǎn)染效率。 方法： 第一部分：以殼聚糖和乳糖酸先合成半乳糖化殼聚糖作為去唾液酸糖蛋白受體的配體，再通過透析法在半乳糖殼聚糖的骨架上偶聯(lián)低分子量PEI，合成半乳糖化殼聚糖.聚乙烯亞胺聚合物，與pEGFP-C1在0.01M PBS、150mmol/L NaCl、5％GS中自組裝成三種不同溶媒介導的GC-PEI/ DNA

2、復合物。通過瓊脂糖凝膠電泳和結合實驗研究三種GC-PEI/DNA復合物結合和組裝DNA能力，并通過血清和DNaseⅠ消化實驗來檢測GC-PEI復合物對DNA的保護能力。為了篩選出最合適的GC-PEI/DNA復合物及其最佳質(zhì)量比，選用透射電子顯微鏡和粒徑分析儀來檢測復合物粒徑大小及形態(tài)，粒徑分析儀進行Zeta電位測定。 第二部分：在體外通過MTT法檢測聚合物對5種細胞（QSG7701、QSG7701/ core、L02、SGC-7

3、901、HBE）的毒性，并將聚合物尾靜脈注入小鼠觀察其體內(nèi)急性毒性反應。 第三部分：GC-PEI聚合物在體內(nèi)外的肝靶向轉(zhuǎn)染效率研究。GC-PEI/DNA復合物分別轉(zhuǎn)染肝細胞系（QSG7701，QSG7701/core，L02）及非肝細胞系（SGC-7901、HBE）細胞，以陽離子脂質(zhì)體lipofectamine TM2000、裸DNA分別做為陽、陰性對照，置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在細胞中的表達及通過流式細胞儀檢測其轉(zhuǎn)染效率

4、。此外，利用血清和游離半乳糖分別檢測二者對GC-PEI聚合物肝靶向轉(zhuǎn)染效率的影響。將二種不同溶媒的GC-PEI/DNA復合物經(jīng)尾靜脈注射導入小鼠體內(nèi)，取肝、心、脾、肺、腎等主要器官做冰凍切片，置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，以裸質(zhì)粒和陽離子脂質(zhì)體lipofect-amine TM2000作為對照。 結果： ①瓊脂糖凝膠電泳和結合實驗結果顯示三種不同溶媒的GC-PEI聚合物均能有效地結合DNA，在聚合物與DNA質(zhì)量

5、比為2.5：1時，聚合物結合DNA能力最佳，與DNA的結合率可達93％。GC-PEI/DNA復合物能保護所攜帶的DNA免受核酸酶和血清的降解。復合物粒徑大小分布于50～200nm之間時，其形成的粒子呈規(guī)則的球形，有明顯的核殼結構。在150mmol/L NaCl中復合物粒徑最大，其次為在0.01M PBS中，在5％GS中復合物形成粒子最小。隨著聚合物與DNA質(zhì)量比的增大（0.25：1～2.5：1），復合物的粒徑、結合能力、zeta電位均發(fā)

6、生明顯的變化，其中復合物的粒徑變小，而DNA結合能力及zeta電位增大。在低質(zhì)量比時，GC-PEI/DNA復合物在150mmol/L NaCl中表現(xiàn)出不穩(wěn)定，出現(xiàn)相互聚集現(xiàn)象。 ②MTT結果表明GC-PEI聚合物在檢測范圍內(nèi)對5種細胞均未顯示出明顯毒性，相對細胞活力值均高于80％；形態(tài)學觀察顯示GC-PEI聚合物50μg/mL組與陰性對照組細胞形態(tài)相似。動物體內(nèi)急性毒性實驗顯示，通過尾靜脈注射50～300μg劑量的GC-PEI聚

7、合物入小鼠后，實驗小鼠兩周內(nèi)無急性毒性反應和死亡發(fā)生；通過HE染色形態(tài)學觀察實驗組小鼠主要器官無明顯病理變化。 ③熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測證實GC-PEI/DNA復合物在肝細胞系（QSG7701，QSG7701/ core，L02）中的GFP表達明顯高于非肝細胞系（SGC-7901，HBE）細胞。GC-PEI/DNA/PBS復合物的轉(zhuǎn)染效率高于GC-PEI/5％GS/DNA組。游離半乳糖可拮抗GC-PEI/DNA復合物在QSG

8、7701/core中的轉(zhuǎn)染效率。GC-PEI/DNA復合物在含血清培基中的轉(zhuǎn)染效率較無血清時略有下降。體內(nèi)實驗表明轉(zhuǎn)染48小時后兩復合物組（GC-PEI/PBS/DNA、GC-PEI/5％GS/DNA）的小鼠肝組織在熒光顯微鏡下可以明顯檢測到綠色熒光點，于轉(zhuǎn)染1周后熒光表達減弱；而心、脾、肺、腎等余主要器官中檢測不到GFP表達；兩對照組肝組織中未見明顯熒光。 結論： （1）GC-PEI聚合物能夠在體內(nèi)外特異性將外源基因?qū)?/p>