硝碘酚腈脂質(zhì)體的制備及肝臟靶向性初步研究.pdf

1、肝片吸蟲病是十分常見的人畜共患寄生蟲病，普遍存在于牛、羊等反芻動物。在我國各省區(qū)呈區(qū)域性流行，一年四季均可發(fā)生，特別是夏秋季節(jié)非常普遍。牛、羊的感染率最高，羊的感染率可達(dá)30％～50％，甚至部分地區(qū)全部感染，牛的感染率有30％～60％，部分地區(qū)90％以上。肝片吸蟲病會致使動物發(fā)育停滯，體重消減，耕牛生產(chǎn)力低下，乳牛產(chǎn)奶量減少，毛和肉產(chǎn)量減少并且品質(zhì)降低，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)虧損。
　　硝碘酚腈(Nitroxynil)是20世紀(jì)6

2、0年代末研制的高效抗肝片吸蟲藥，對肝片吸蟲和大片吸蟲的成蟲期均都具有很高的療效，然而藥物與血漿蛋白具有高度結(jié)合力（結(jié)合率＞97％），使游離硝碘酚腈在組織內(nèi)集聚量很少，以致在推薦劑量下，肝實質(zhì)中的藥物濃度不足以殺滅未成熟的幼蟲。在臨床中肌內(nèi)注射與皮下注射為首選方式，然而在給藥部位發(fā)生炎性腫脹，動物出現(xiàn)搖頭、走路搖晃、呼吸急促甚至死亡等現(xiàn)象。
　　脂質(zhì)體作為藥物的載體系統(tǒng)，將藥物包封于脂質(zhì)雙分子層中，可以提高藥物在機(jī)體內(nèi)的靶向性，增強(qiáng)

3、治療效果，降低毒副作用，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)臨床中得到廣泛的應(yīng)用。脂質(zhì)體雙分子層生物膜主要由磷脂和膽固醇組成，未經(jīng)修飾的脂質(zhì)體經(jīng)靜脈給藥進(jìn)入動物機(jī)體中，被巨噬細(xì)胞作為“侵入者”吞噬而產(chǎn)生天然靶向性，主要由肝和脾中的吞噬細(xì)胞（網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞）吞噬，因此脂質(zhì)體是用于治療肝寄生蟲病、利什曼原蟲病等肝臟內(nèi)寄生蟲病的理想藥物載體。
　　本試驗使用脂質(zhì)體包封技術(shù)制備硝碘酚腈脂質(zhì)體，旨在提高其有效生物利用度、延長作用時間、降低藥物毒性作用，并探究其臨床使用

4、意義。
　　1硝碘酚腈脂質(zhì)體的制各
　　方法:采用薄膜超聲法制備硝碘酚腈脂質(zhì)體，以磷脂-膽固醇質(zhì)量比(A)、藥脂比(B)、超聲時間(C)、水化溫度(D)四個因素進(jìn)行正交試驗設(shè)計L9(34)，以包封率為指標(biāo)，篩選最佳工藝。
　　結(jié)果:經(jīng)試驗數(shù)據(jù)分析，各因素對工藝的影響程度:B＞A＞D＞C。最佳工藝處方為:磷脂-膽固醇質(zhì)量比為2∶1，藥脂比為3∶1，超聲時間6min，水化溫度40℃。經(jīng)重復(fù)性驗證該處方包封率為50.05±1

5、.62％。
　　結(jié)論:本試驗篩選出的處方及工藝所制各的硝碘酚腈脂質(zhì)體包封率較好、重現(xiàn)性好。
　　2硝碘酚腈脂質(zhì)體的質(zhì)量評價
　　2.1 HPLC測定脂質(zhì)體中硝碘酚腈含量方法的建立
　　方法:色譜條件:流動相:乙腈-0.01 mol/L磷酸鹽pH6.5(25∶75，V/V);色譜柱:Phenomenex-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）;流速:1.5 mL/min;柱溫:40℃;檢測波長:271 nm;

6、進(jìn)樣量:10μL。
　　結(jié)果:經(jīng)方法學(xué)驗證，該色譜條件適合硝碘酚腈含量測定，出峰時間合適，峰形對稱，與其他雜質(zhì)峰分離度良好，重現(xiàn)性與精密度均符合要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=25250x-173662，R2=0.9999，線性范圍:10～400μg/mL。
　　2.2粒徑的測定
　　方法:使用Zetasizer Nano分析儀動態(tài)光散射法測定脂質(zhì)體粒徑大小。
　　結(jié)果:硝碘酚腈脂質(zhì)體粒徑于200-300nm呈正態(tài)分布。

7、r>　　2.3包封率測定
　　方法:以葡聚糖凝膠柱內(nèi)徑與填充高度比(A)，加樣量(B)，流速(C)三個因素設(shè)計正交試驗，篩選葡聚糖凝膠柱分離硝碘酚腈脂質(zhì)體的最佳條件，收集脂質(zhì)體流出液，使用HPLC測定硝碘酚腈含量，計算包封率。
　　結(jié)果:使用100-300μm的葡聚糖凝膠G-50作為層析基質(zhì)，葡聚糖凝膠柱內(nèi)徑與填充高度比:2∶7，加樣量:1.0mL，流速:1mL·min-1。洗脫曲線顯示，脂質(zhì)體洗脫時間為4-15min。收集

8、流出液用10％Trixton-100溶液破乳，用HPLC測定硝碘酚腈含量。
　　結(jié)論:本試驗方法制得脂質(zhì)體粒徑分布較均勻，使用葡聚糖凝膠柱分離硝碘酚腈脂質(zhì)體出峰時間合適，可以有效分離硝碘酚腈脂質(zhì)體與游離硝碘酚腈。
　　3硝碘酚腈脂質(zhì)體在家兔體內(nèi)藥動學(xué)試驗
　　方法:選擇健康家兔2組，比較耳緣靜脈注射相同劑量(8.8mg/kg)的硝碘酚腈注射液與硝碘酚腈脂質(zhì)體，分別于5min,10min，15min、30min、45mi

9、n、1h、1.5h、2h、4h、8h、12h、24h、36h采血，使用上述HPLC方法測定含量，用3P97軟件分析藥動學(xué)模型以及藥動學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果:HPLC繪制血液中硝碘酚腈標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=27547x-31146，R2=0.9995。線性范圍均為6.25～400μg/mL。
　　硝碘酚腈注射液和硝碘酚腈脂質(zhì)體耳緣靜脈注射后的血藥濃度-時間分布均符合一級吸收二室模型。
　　硝碘酚腈注射液在家兔體內(nèi)主要動力學(xué)參數(shù)為:

10、A=14.44±1.25μg/mL，α=3.10±0.37/h, B=15.50±2.88μg/mL,β=0.031±0.0028/h,V(c)=0.29±0.00083(mg/kg)/(μg/mL),T1/2α=0.22±0.0028h; T1/2β=22.21±2.48h,AUC=501.18±35.76(μg/mL)*h, CL(s)=0.018±0.0007 mg/kg/h/(μg/mL)。
　　硝碘酚腈脂質(zhì)體在家兔體內(nèi)主

11、要動力學(xué)參數(shù):A=8.85±0.71μg/mL，α=1.80±0.25/h，B=13.08±1.22μg/mL,β=0.0155±0.002/h,V(c)=0.4±0.025(mg/kg)/(μg/mL),T1/2α=0.38±0.011h, T1/2β=44.83±0.29h, AUC=851.30±48.37(μg/mL)*h, CL(s)=0.0103±0.0009mg/kg/h/(μg/mL)。硝碘酚腈脂質(zhì)體消除半衰期延長（T1

12、/2β）、中央室分布容積(Vc)增大，與硝碘酚腈注射液比較有極顯著差異(p＜0.01)。
　　結(jié)論:硝碘酚腈脂質(zhì)體在家兔體內(nèi)消除半衰期顯著延長、中央室分布容積增大，生物利用度升高，揭示其具有緩釋作用。
　　4硝碘酚腈脂質(zhì)體的肝臟靶向性初步研究
　　選擇健康KM小鼠2組，尾靜脈注射相同劑量的硝碘酚腈注射液與硝碘酚腈脂質(zhì)體，分別于15min、30min、45min、1h、2h、4h、8h、12h、24h解剖小鼠，采集肝臟組

13、織，使用上述HPLC分析方法進(jìn)行含量測定。
　　結(jié)果 HPLC繪制肝臟組織標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=26156x+36621，R2=0.9996。線性范圍為6.25～400μg/mL。硝碘酚腈注射液與硝碘酚腈脂質(zhì)體肝臟中AUC注=87.00(μg/mL)*h，AUC脂=197.29(μg/mL)*h，肝臟相對攝取率re=2.27。
　　結(jié)論:硝碘酚腈脂質(zhì)體中肝臟re=2.27，AUC洼與AUC脂差異極顯著，表明具有良好的靶向性。