制備和鑒定腦靶向性脂質(zhì)體P-MMA-DOSPER.pdf

1、研究背景：中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的穿梭載體主要有病毒載體和非病毒載體兩類，由于兩者有著各自不同的缺點(diǎn)，還不能作為理想的基因載體運(yùn)用于臨床。而載體的選擇是基因治療的關(guān)鍵，所以研究者們不遺余力的尋找安全、高效、穩(wěn)定的基因載體。相對(duì)于病毒載體脂質(zhì)體優(yōu)點(diǎn)在于安全、無(wú)免疫源性，缺點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移效率低。因此，脂質(zhì)體的研究主要集中于提高基因轉(zhuǎn)移效率方面。偶聯(lián)了抗體的免疫脂質(zhì)體就是通過抗體的靶向特異性實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體在某些組織器官的聚集來(lái)提高基因轉(zhuǎn)移效率。

2、 目的1.探求將脂質(zhì)體構(gòu)建成為更理想的腦內(nèi)基因轉(zhuǎn)移穿梭載體的方法。2.以神經(jīng)干細(xì)胞表面抗原為靶位，以衍生化單克隆抗體偶聯(lián)脂質(zhì)體腦內(nèi)尋靶，使基因治療更具目的性，提高基因轉(zhuǎn)移效率。 方法1.使用LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)pEGFP-C2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的JM-109大腸桿菌，以質(zhì)粒抽提試劑盒提取大量pEGFP-C2質(zhì)粒。經(jīng)過酶切電泳、DNA測(cè)序鑒定并以紫外分光光度法檢測(cè)質(zhì)粒濃度及純度后用于基因轉(zhuǎn)染。2.以二棕櫚酸磷

3、脂酰乙醇胺(DPPE)對(duì)單克隆抗體(anti-Lex/SSEA-1)進(jìn)行衍生化，采用透析法分離純化衍生化抗體、紫外分光光度法檢測(cè)抗體衍生化的效率，間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)法檢驗(yàn)衍生化后抗體的活性。實(shí)驗(yàn)中用碳二亞胺法把衍生化的單克隆抗體P-MMA與陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOSPER共價(jià)偶聯(lián)，制成有腦靶向性的脂質(zhì)體P-MMA-DOSPER。超速冷凍離心分離純化P-MMA-DOSPER，采用紫外分光光度法檢測(cè)抗體與脂質(zhì)體的偶聯(lián)率。3.P-MMA-DOSPER與

4、DOSPER分別包封綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C2)，分兩組注入40只SD大鼠的側(cè)腦室內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。脂質(zhì)體通過腦室管膜到達(dá)腦實(shí)質(zhì)把質(zhì)粒轉(zhuǎn)移入神經(jīng)干/祖細(xì)胞。第1、3、7、14天取腦冰凍切片，抗nestin抗體免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察基因表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組數(shù)據(jù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)合SNK檢驗(yàn)；兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。P＜0.05為差別有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1.質(zhì)粒

5、抽提試劑盒提取質(zhì)粒約200μl，酶切電泳及DNA測(cè)序確定為pEGFP-C2質(zhì)粒，紫外分光光度法檢測(cè)pEGFP-C2質(zhì)粒濃度為1.596μg/μl，Dλ260/Dλ280=1.975純度完全符合基因轉(zhuǎn)染要求；2.衍生化的單克隆抗體P-MMA活力有所下降約為原單克隆抗體MMA活力的1/4，間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA)顯示P-MMA與抗原Lex/SSEA-1仍具有足夠的特異性結(jié)合能力，能夠識(shí)別并標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞；在偶聯(lián)促進(jìn)劑碳二亞胺的作用下單克隆

6、抗體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體共價(jià)偶聯(lián)率可以高達(dá)73.7％。3.大鼠腦組織切片在熒光顯微鏡下可見注射一側(cè)側(cè)腦室周圍GFP表達(dá)，尤以側(cè)腦室角多見，偶見于對(duì)側(cè)側(cè)腦室、第三腦室。其中轉(zhuǎn)染后1天，GFP表達(dá)量較少、不穩(wěn)定且主要集中于室管膜下區(qū)，轉(zhuǎn)染后3至7天GFP表達(dá)明顯增多、增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后14天仍可見GFP表達(dá)但有減弱趨勢(shì)。各時(shí)間點(diǎn)P-MMA-DOSPER組的GFP+/nestin+細(xì)胞在nestin+細(xì)胞中比率均高于DOSPER組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

7、＜0.01)，兩組中轉(zhuǎn)染后1天的GFP+/nestin+細(xì)胞在nestin+細(xì)胞中比率低于3、7、14天，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而其余各時(shí)間點(diǎn)之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論衍生化的單克隆抗體P-MMA活力有所下降，但仍與抗原Lex/SSEA-1具有足夠的特異性結(jié)合能力，能夠識(shí)別并標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，并且衍生化的單克隆抗體與陽(yáng)離子脂質(zhì)體能夠獲得較高的共價(jià)偶聯(lián)率；P-MMA-DOSPER能夠包封pEGFP-