組織因子介導(dǎo)Genistein復(fù)合物靶向抗癌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、流行病學(xué)調(diào)查顯示，東亞地區(qū)人群中乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等的發(fā)生率和死亡率均低于歐美國(guó)家，且與東亞地區(qū)居民食用較多的豆制品有一定關(guān)系。后分析發(fā)現(xiàn)大豆中含有豐富的異黃酮類(lèi)化合物，天然的大豆異黃酮共有12種，其中5，7，4’-三羥基異黃酮(genistein，Gen)是發(fā)揮藥理作用最重要的成分之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似雌激素，且有低雌活性，故又稱(chēng)其為植物雌激素。近年來(lái)，大量研究證實(shí)Gen具有廣泛的抗癌作用，其作用機(jī)制包括特異性抑制蛋白酪氨酸激酶(

2、proteintyrosinebinase，PTK)，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性，抑制腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化等，高濃度的Gen(≥60μM)還可引起腫瘤細(xì)胞G2/M周期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)本所前期研究顯示Gen還具有一定的造血輻射防護(hù)效果，可以與腫瘤放療產(chǎn)生協(xié)同作用。因此Gen是一種極有價(jià)值的潛在抗癌化合物。但由于Gen在體內(nèi)分布特異性不強(qiáng)，必須大劑量使用才能達(dá)到有效殺傷腫瘤細(xì)胞濃度，而量大又有累積性雌活性增高之弊。如果選定腫

3、瘤細(xì)胞高表達(dá)的某種受體，將Gen與其特異性配體連接，利用配體-受體特異性結(jié)合的特性，將Gen帶入腫瘤局部形成高濃度，就可以在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)減少Gen對(duì)非瘤組織的副作用。 組織因子(tissuefactor，TF)，又稱(chēng)凝血因子Ⅲ，是一種跨膜糖蛋白受體，能夠識(shí)別和結(jié)合凝血因子Ⅶ(factorⅦ，fⅦ)，啟動(dòng)外源性凝血反應(yīng)。近年來(lái)眾多臨床觀察及體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)：TF在腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞和許多惡性腫瘤如結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌

4、和乳腺癌等細(xì)胞表面存在高表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤患者血液凝固性增高，并具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的作用。由于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞表面并不表達(dá)TF，所以能夠與TF結(jié)合的配體經(jīng)靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后主要與腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，聚集在腫瘤組織局部。因此，TF堪稱(chēng)靶向抗癌藥一個(gè)很好的作用“靶點(diǎn)”。 國(guó)外研究學(xué)者最近為研究TF胞外區(qū)的關(guān)鍵酶促反應(yīng)區(qū)域，從M13噬菌體二硫鍵限制的七肽庫(kù)中成功篩選出一類(lèi)含谷氨酸(E)和精氨酸(R)，即-ECLRSVVTC-

5、模序的環(huán)形多肽，此類(lèi)多肽能夠與TF結(jié)合但不會(huì)引發(fā)外源性凝血，這為利用TF實(shí)現(xiàn)靶向抗癌提供了理論依據(jù)和技術(shù)途徑。 基于以上文獻(xiàn)依據(jù)和構(gòu)思設(shè)想，本課題擬設(shè)計(jì)、合成一種能夠與TF特異結(jié)合且無(wú)凝血活性的小分子多肽，通過(guò)異型雙功能交聯(lián)劑將此多肽與Gen交聯(lián)，構(gòu)建成一種新的靶向抗癌復(fù)合物，以達(dá)到有效提高Gen抗癌治療指數(shù)的目的。目前，尚無(wú)類(lèi)似研究報(bào)道。 研究?jī)?nèi)容主要分四個(gè)部分： 1.檢測(cè)TF在各種類(lèi)型癌組織和對(duì)照癌旁組織中的

6、表達(dá)，明確TF的分布特性。 2.設(shè)計(jì)、合成能夠與TF特異性結(jié)合的小分子多肽，命名為FHS001。然后通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑Sulfo-SANPAH將FHS001與Gen進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，制備FHS001-Gen復(fù)合物。 3.分別用99mTc和125I標(biāo)記FHS001-Gen和Gen，示蹤分析FHS001-Gen的體內(nèi)分布。 4.檢測(cè)FHS001-Gen復(fù)合物的體外、體內(nèi)抗癌作用。 獲得的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1

7、.采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)了55例來(lái)自附屬西南醫(yī)院的病人癌組織切片。在癌組織中都能夠檢測(cè)到TF的表達(dá)，陽(yáng)性率高達(dá)96.4％，且以強(qiáng)陽(yáng)性(+++)居多，所有不同亞型結(jié)直腸癌17例、胃癌11例、肺癌6例的腫瘤細(xì)胞表面和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均有TF的特異性高表達(dá)。結(jié)果說(shuō)明癌細(xì)胞表面和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面有TF的特異性高表達(dá)；而檢測(cè)的對(duì)照癌旁組織中TF僅在腎小球細(xì)胞和部分腸上皮細(xì)胞表面有表達(dá)，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞表面不表達(dá)TF。因此，TF可以用于

8、作為靶向抗癌藥物定位的一個(gè)新“靶點(diǎn)”。 2.分別在-ECLRSVVTC-序列的兩端加上保護(hù)性氨基酸：甘氨酸(G)。為方便交聯(lián)反應(yīng)在末端各加上一個(gè)賴(lài)氨酸(K)和酪氨酸(Y)。序列中兩個(gè)半胱氨酸(C)之間的二硫鍵形成環(huán)化分子，采用固相合成法成功合成所設(shè)計(jì)的小分子多肽-FHS001，序列為GECLRSVVTCGGKY，分子量為1469.7:Da。正常人血漿和乏fⅦ人血漿分別加入不同濃度的FHS001后，測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)，高濃度

9、的FHS001對(duì)正常人血漿和乏FⅦ人血漿的PT沒(méi)有明顯影響，PT實(shí)驗(yàn)證實(shí)其沒(méi)有凝血活性。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)FITC標(biāo)記的FHS001加入體外細(xì)胞培養(yǎng)體系后，高表達(dá)TF的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞表面有綠色熒光顯示，而低表達(dá)TF的人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304.表面基本無(wú)熒光顯示。提示FHS001與細(xì)胞表面TF胞外區(qū)能夠很好地結(jié)合，因此FHS001可以作為抗癌藥物的靶向載體。 3.FHS001與Gen的交聯(lián)反應(yīng)分兩步進(jìn)行：第一步將過(guò)量的

10、化學(xué)交聯(lián)劑Sulfo-SANPAH與FHS001在PH=7.0的緩沖液中交聯(lián)，此時(shí)Sulfo-SANPAH一端的N-琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)釋放出N-羥基琥珀酰亞胺，水解活化，并與FHS001中賴(lài)氨酸的ε-氨基形成穩(wěn)定的酯鍵結(jié)構(gòu)。第二步另一端的硝基苯基疊氮在特定波長(zhǎng)的UV照射下解離活化成活性芳香氮基團(tuán)，F(xiàn)HS001-SANPAH與Gen7位上的羥基交聯(lián)。反應(yīng)完畢經(jīng)HPLC純化、質(zhì)譜鑒定獲得最終產(chǎn)物FHS001-Gen，復(fù)合物純度＞95％；質(zhì)

11、譜鑒定其相對(duì)分子量為1973.4Da，推算其分子中FHS001載體與藥物Gen的摩爾比為1:1。 4.采用直接標(biāo)記法成功獲得99mTc標(biāo)記的FHS001-Gen和125I標(biāo)記的Gen，兩種產(chǎn)物的放射比活性分別為932KBq/μg和336KBq/μg，放化純度分別為96.5％和98.7％，可以用于體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)的研究。 5.體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)以荷MCF-7皮下移植瘤裸鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，裸鼠尾靜脈給藥后分別于10min、30min、60

12、min、120min、240min等各時(shí)相點(diǎn)取材，測(cè)定腫瘤及血液、肝、腎、腸、肺等各組織的放射性，計(jì)算腫瘤(T)與非腫瘤組織(NT)的放射性比值。結(jié)果99mTc-FHS001-Gen尾靜脈給藥10min后腫瘤及血液、肝、腎、腸、肺等各組織的放射性均達(dá)到峰值，之后逐漸下降。藥物主要集中在腫瘤及血液、肝、腎等組織；腫瘤組織的放射性至60min時(shí)高于除腎臟外的所有受檢組織，T/NT比值在1.12-4.76之間，120min時(shí)T/NT值達(dá)到最高

13、，最大的瘤/肺比值達(dá)到4.87，有一定的腫瘤靶向性分布。相反125I-Gen給藥后各組織中都有分布，腫瘤組織分布較少。30min后各組織放射性達(dá)到高峰，但在各時(shí)相點(diǎn)腫瘤(T)放射性均顯著低于血液、肝臟與腎臟(NT)(P＜0.01)，說(shuō)明Gen的分布沒(méi)有腫瘤靶向性。99mTc-FHS001-Gen組腫瘤組織的比放射性明顯高于相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)的125I-Gen組動(dòng)物，因此復(fù)合物提高了Gen在腫瘤組織的分布。 6.采用MTT法檢測(cè)了不同濃度

14、的FHS001-Gen和Gen對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果FHS001-Gen在0.2-200.0μM的濃度范圍內(nèi)對(duì)MCF-7細(xì)胞均有不同程度的增殖抑制作用，抑制率均＞16％，為16.3％-83.1％，且呈一定的劑量依賴(lài)性，藥物濃度越大抑制作用越明顯。Gen的濃度＜20.0μM時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯，F(xiàn)HS001-Gen和Gen對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50分別為2.0μM和120μM，F(xiàn)HS001-G

15、en的效果明顯優(yōu)于未交聯(lián)的Gen(P＜0.05)。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)表明，荷MCF-7皮下移植瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射給藥后，F(xiàn)HS001-Gen能夠有效抑制MCF-7皮下移植瘤的生長(zhǎng)，F(xiàn)HS001-Gen組的腫瘤抑制率達(dá)到61.9％，比Gen組(抑制率為44.6％)的抑瘤效果更好(P＜0.05)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果空白對(duì)照組、Gen給藥組和FHS001-Gen給藥組的MVD分別為48.0±11.2/HP、24.6±5.5/HP和16.2±4.7

16、/HP，給藥組瘤內(nèi)血管密度均明顯小于空白對(duì)照組(P＜0.01)。FHS001-Gen給藥組效果較Gen給藥組更為突出，相差顯著(P＜0.05)。FHS001-Gen對(duì)腫瘤血管的破壞可能是其發(fā)揮抗癌作用的一個(gè)重要因素。 研究結(jié)論如下： 1.TF在多種不同類(lèi)型的癌細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均有高表達(dá)，是一個(gè)值得關(guān)注的抗癌新“靶點(diǎn)”。 2.我們針對(duì)TF設(shè)計(jì)、合成的小分子多肽-FHS001，沒(méi)有凝血活性且保留了與TF的結(jié)